HE染色苏木精——伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。染色物质分类易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性(basophilia)和嗜酸性(acidophilia)。组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。HE染色的基本原理细胞核染色的原理细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。细胞浆染色的原理细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，此时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。染色结果细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。二甲苯的作用烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去，染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同，以便显微镜观察。酒精的作用酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯使水额能进入细胞和组织中。伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份，为二甲苯进入细胞创造条件，否则组织切片透明度达不到光学显微镜观察的透光度的要求。水洗的作用在脱蜡经酒精处理之后，水洗切片，是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去，使细胞核染色均匀。染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料，中止分化作用。在伊红染色之后也可以水洗，是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。分化作用苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化作用分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化再用温水或弱碱性水使染上苏木精的细胞核变蓝色，称蓝化作用，以自来水浸洗或温水变蓝为佳。溶液配制Harris苏木精液苏木精1g无水酒精10ml硫酸铝钾或硫酸铝铵20g蒸馏水ml先将苏木精溶于酒精，再将矾放进蒸馏水中，把苏木精液与矾液混合后，电炉加热溶解，待到煮沸后离开电炉，稍候片刻慢慢加入氧化汞0.5g。然后使液体迅速冷却，过滤后使用，使用前每ml苏木精加入冰醋酸4ml改良明矾苏木精液A液苏木精2g95或%乙醇20ml加热溶解。B液硫酸铝钾16g加热溶解后加入蒸馏水ml冷却后加入A液，然后加入碘酸钠（准确称量）mg搅拌三次，每次5分钟，30分钟后加冰醋酸10ml即可使用。新配制的苏木精染色时间2分钟。注意事项：1．切片脱蜡至水后先用蒸馏水洗再入苏木精染色。2．使用一周后苏木精会变蓝一些，这时可往液苏木精液中加2-10ml冰醋酸，过滤后使用。Mayer苏木精明矾液10%苏木精乙醇掖10ml碘化钠0.2g钾明矾或铵矾50g水合氯醛50g枸橼酸1g蒸馏水0ml用蒸馏水溶解固体然后加入苏木精液。伊红水溶液配制伊红水溶液伊红Y0.5g蒸馏水ml先用少量蒸馏水溶解伊红，再用玻璃棒搅拌溶解，完全溶解后加入剩余的蒸馏水。盐酸乙醇液配制盐酸乙醇液75%乙醇ml浓盐酸0.5ml蓝化液1Scott’sTapWater/Bluing硫酸镁（MgSO4）30g碳酸氢钠2g自来水0ml充分混合，标记液体日期。20.05%碳酸锂碳酸锂0.5g蒸馏水0ml充分混合，标记液体日期。3氨水氢氧化铵5ml蒸馏水0ml充分混合，标记液体日期。对事先冻存过的组织会引起脱片。实验步骤脱蜡二甲苯I10分钟二甲苯II5分钟水化%酒精I5分钟%酒精II5分钟95%酒精I5分钟95%酒精II5分钟85%酒精3分钟75%酒精2分钟蒸馏水冲洗1分钟染色苏木精染色5分钟自来水洗盐酸酒精分化15秒自来水洗（镜检）自来水洗15分钟蒸馏水洗2分钟75%酒精2分钟85%酒精2分钟0.5%伊红染色1分钟95%酒精I5分钟95%酒精II5分钟%酒精I5分钟%酒精II5分钟二甲苯I5分钟二甲苯II5分钟封片中性树胶封片上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡。注意事项1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。6．用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。7．在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。冰冻切片染色步骤（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。封片切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。HE染色常见问题与对策1、切片在脱蜡后出现大片白色的斑点原因：由于烤(烘)片温度太低，玻片在脱蜡前没有充分烤(烘)干；切片在二甲苯停留时间不足，或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。对策：如果玻片是由于没有烤(烘),先用无水乙醇处理去除玻片上的水分，然后重新用二甲苯脱去石蜡。如果烤(烘)干不足的现象比较严重，可能导致切片脱落，则无法补救。如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成，或使用的二甲苯过久，切片则需退回到二甲苯停留时间相对长些，或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色。2、细胞核染色苍白、暗淡，即苏木精染色太淡原因：此类问题可能影响因素，切片在苏木精染色液停留时间太短；苏木精染色液过度氧化，失去染色能力，不能再继续使用；分化步骤处理时间过长。如果是骨组织细胞核暗淡，则多数是由于脱钙过度造成。对策：切片重新染色。如果组织在酸性固定液及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加其在苏木精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善细胞核的着色。例如：建议上述组织切片最好使用Weigert铁苏木精染色液；如果组织是用Zenker液固定的，可将切片脱蜡后放在5%碳酸氢钠溶液3～4h，流水冲洗5min后染色；如果组织是用Bouin液固定的，可将切片脱蜡后放在5%碳酸锂1h，流水冲洗10min后染色。3、细胞核过染，即苏木精染色太深，甚至苏木精染液的分布占据了胞质的位置原因：此类问题可能影响因素，即切片在苏木精染色液停留过长；切片太厚；分化步骤时间太短。对策：如果切片不是因为太厚(用显微镜仔细上下调节微调，只有一二层细胞核层次)，脱色、漂白、重新染色，对于染色和分化时间做些适当的调整。如果确定是由于切片太厚导致的细胞核过染，则需要重新切片。4、细胞核呈红、棕色改变原因：主要有苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。对策：首先，每次染色之前检查苏木精染色液的染色能力，发现氧化过度应及时更换。其次，可用流水、温水或弱碱性溶液如稀氨水、0.2%碳酸氢钠等，在苏木精染色后，给切片以足够的蓝化时间。5、伊红着色淡原因：伊红染液的pH值可能大于5；也可能是蓝化液残留过多；切片太薄；或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。对策：检查伊红染液的pH值，如果必要的话，用乙酸将其调节在4.16～5.10之间，从而使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化步骤完成后，使用的弱碱性溶液被充分洗去，玻片上没有残留的弱碱性溶液。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长，因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。6、细胞质过染、分色不足原因：伊红染色液浓度太高，特别是焰红燃料、四溴四氯荧光素钠的存在；切片在伊红染色时间过长；切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快，而使乙醇分化伊红的作用不能产生。对策：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间，或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀。同样，也要检查切片的厚度是否合适。7、切片中出现蓝黑色沉淀物原因：苏木精染色液中的金属膜，黏附在玻片上。对策：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液，如Gill苏木精染色液，可以避免过多的金属膜产生。8、显微镜下见切片内有大量水珠原因：切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水，导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。对策：移去盖玻片，用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后，用新二甲苯透明，中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应即时更换。9、光镜下切片某些区域难以聚焦原因：盖玻片上可能有封固切片的封固剂。对策：移去盖玻片，重新用干净的盖玻片封片。检查切片封片方法，是人工手工封法，还是机器自动封法，如有问题及时调整。10、封固剂从盖玻片与载玻片之间的缝隙回缩原因：盖玻片弯曲或不平整；封固剂含二甲苯过多，稀释过度。对策：移去盖玻片，重新找一张盖玻片，用干净的封固剂封片。如用手工封片法，每天保证盛装封固剂的容器，在封固结束的时候盖紧盖子。尽量使用小的容器盛装封固剂，一旦封固剂太粘稠，就可以废弃不再使用。11、切片从脱蜡的二甲苯经过梯度乙醇进入水溶液时，水和玻片呈现乳白色混浊改变原因：用于脱蜡的二甲苯没有被乙醇洗干净。对策：更换洗涤二甲苯的乙醇液体，把切片重新放回无水乙醇，脱去玻片上的水分。12、细胞核灰蓝原因：可能的原因是由于组织处理温度过高、过热，在石蜡停留的时间过长；或者固定时间太短，接下来就直接在高浓度的乙醇中行脱水处理。对策：理论上来说，加热处理仅在组织浸蜡步骤才使用，组织不能在热的蜡液中停留过长时间。如果由于某些原因不能进行下步包埋处理，完成浸蜡处理后的组织，可将组织连同塑料包埋盒一并放置在室温空气中，冷却凝固，以备包埋。待需要包埋时再重新加温直至石蜡融化即可。组织在处理前必须确保固定良好，脱水最好能从低浓度的乙醇开始。13、HE染色不规则或不均匀，从小斑点到大面积区域，散布切片各处，细胞核染色质不够细致原因：由于使用密闭式组织处理机故障，如密闭不严，导致组织浸蜡时含有水和(或)固定剂。对策：如果使用开放式组织处理模式，在相对湿度较高的地方，用甲苯替代二甲苯。如果使用密闭式组织处理模式，经常仔细检查仪器设备的各项功能是否完好，一旦发现密闭垫圈老化，应及时更换。14、细胞核和细胞质着色深，呈强嗜碱性，特别是在组织的边缘原因：因激光或电切技术，导致大体组织标本变性，通常使得细胞核和细胞质被深染呈强嗜碱性着色。对策：目前还没有针对这一人为改变的有效方法15、切片中出现类似色素样的点状结晶和黑色光滑的细胞核俗称裸核改变原因：切片封片前放置在空气中时间太长，以至于二甲苯挥发切片干燥所致。对策：移去组织切片上的盖玻片和封固剂，重新处理。将切片水洗数分钟，然后重新脱水、透明、封固。封片过程中要保持组织切片的轻度湿润，尽量不要让其干燥。在组织切片时，夏天温度高，在常温下染色可以达到目的，但是冬季温度低，应该在恒温箱内染色，且最理想的HE染色的温度应该控制在32～37℃之间。温度低了，组织块之间脱蜡就不完全，引起细胞核模糊不清，染色着色不明显，并且细胞之间的界限也不清晰；温度高了又会使得细胞破裂，组织结构之间出现裂痕，细胞核着色不明显或发灰。石蜡切片HE染色过程，首先配制好试剂是关键:①苏木精染液的配制在加入冰醋酸时要适量，加多了影响细胞核着色力，加少了引起核浆共染，切片背景不清晰。冰醋酸适量的加入抑制了苏木素对胞浆的着色力。所以将冰醋酸的加入量控制在总液量的4%。当染液用过一段时间后，有效成分散失引起核浆共染时此液就不可使用了。②若采用加温染色时，温度应控制在35～40度之间，太高了致使物理性染色作用增强，造成核浆共染，不易分化，最终导致染色失败。③1%稀盐酸的分化，可在镜下控制核的染色，若是产生核浆共染现象，盐酸分化起不到任何作用，因为分化到胞质无色，则核太浅，若核适中，胞质定会不清晰呈蓝色。所以只能重新更换苏木素染液，方能保证细胞核的染色。④伊红染液的pH值调节是胞质染色的关键，根据经验，毫升的1%伊红液加入1滴的冰醋酸即可，使染液的pH值小于蛋白质的等电点，胞质易被酸性的伊红液呈色。常规HE染色易出现的问题、原因及解决方法1、染色中组织切片脱落的原因1.1 组织自身原因及处理不当①组织自身原因,如凝血块、血栓、干涸或过硬的组织及组织碎屑等，其切片染色时易脱落;②组织脱水、透明不足，以致石蜡不能浸入勉强切出的片子，脱蜡时收缩，入水或染色后又膨胀，因而易脱落；③组织脱水、透明过度，浸蜡时间过长或温度太高，引起组织收缩硬脆，导致切片不完整，染色时导致脱落。对发脆的组织可选用下面方法处理，使切片完整、不易脱片：①用棉球蘸5%氨水或20%冰醋酸涂抹蜡块组织表面10s左右；②蜡块修出组织面，放入冰水混合液中几分钟或用冰块贴敷组织面。1.2 切片①切片过厚，组织附贴在载玻片上不平，使切片与玻片之间存有一定间隙，切片与玻片之间的吸附力减弱；②破碎不整齐的切片；③展片水温低，切片有皱褶、附贴不牢或附贴时切片下含有气泡；④烤片时间短或温度低、烤片温度过高或时间过长、组织被烤焦或收缩变形发生皱褶均易脱片；⑤载玻片清洗不洁净，含有油脂或混入脏东西等。故载玻片应先放入清洗液内浸泡，捞出后彻底水洗，95%乙醇进一步脱脂，而后干燥箱烘干备用。现多采用免洗载玻片，效果较好。对于特殊组织要进行特殊处理，如脑、脊髓等组织，捞片后不能马上直接烤片，待切片与载玻片之间水分充分沥干后再放到烤片箱的铁板上进行烤片，以避免切片出现气泡。1.3 染色 ①脱蜡后未经自高至低的各级乙醇缓冲调解逐渐入水；②染色时，用水冲洗过猛或振荡过度，致切片与载玻片脱离；③染液或试剂的酸碱度不适宜或在其中停留时间过久，如染色所用的返蓝液碱性过大时易引起切片脱落。针对这种现象，我们可以采用自来水返蓝，因为自来水多呈弱碱性，pH7.5～7.8，同样可达到返蓝目的；④HE染色过程中，切片多用1%盐酸乙醇进行分化，工作中发现，脱片也易发生在盐酸乙醇分化后。1%盐酸乙醇的分化作用主要依靠盐酸在水中容易电离出氢离子，用来改变组织的电荷性质，使过染和吸附在组织表面的染料从组织中及表面脱落下来，从而达到分化的目的。根据盐酸的性质，盐酸在水中电离出的氢离子要比在乙醇中电离出的氢离子多,我们认为传统的1%盐酸乙醇用于分化乙醇在这里并不起作用,相反,由于乙醇的存在致使切片更易脱落,因为乙醇具有脱水及使组织收缩的作用，分化后水洗时组织又发生吸水、膨胀。而造成脱片。为此，我们认为改用1%盐酸水溶液进行分化，可避免脱片现象的发生；⑤染色失当或效果不良，返工重做；⑥染液及染色用具不洁净；⑦脱片与水质有关。由于各地区水质不同，有的地区自来水内含有大量的矿物质，故漂片用水的纯净与否亦是造成组织脱片的一个重要因素。2、切片染色不均的原因2.1组织取材固定不当如组织取材过大或过厚、所用之固定液浓度过大、穿透力较小时，不能将组织完全固定，组织切片染色后出现切片外周固定好的部位细胞着色清晰，但中间或未固定好的组织细胞着色模糊，从而造成染色不均。2.2组织脱水时间过短组织中含有水分，进而使透明、浸蜡不彻底。这种处理不彻底的组织，虽然有时也能勉强切片，但切片薄厚不均，在染色时就会出现染色不均，片状灰染现象。2.3切片厚薄不均或有横纹2.4染色过程处理不当①组织切片脱蜡不彻底，如溶蜡剂及乙醇不纯或使用时间过久、室温低时，组织切片上的石蜡没有全部除掉时、含蜡部分不着色或着色较浅而无蜡部分着色较深，因此造成染色深浅不均；②染液或试剂量少，组织切片没被全部浸染到；③分化不当、分化剂浓度过大、分化力过强、分化后没有迅速入水终止分化，可造成染色过淡、过深或染色不均等现象；④如果组织切片上有气泡，则气泡内的组织可能染不上色，以致镜下出现染色不均现象。3、切片染色模糊不清(灰染)的原因3.1 取材 在取材时组织标本已经发生霉腐自溶，或取材后没能及时固定、固定液浓度不够，必然造成组织结构模糊不清，这是由于组织结构分解变性、组织变酸所致，因而切片被染成灰蓝色。另外，固定前已干枯的标本，染色后易在干枯区域内出现成片的灰染现象，很难补救。3.2 固定 ①固定剂对组织有一定的媒染作用，它既可与蛋白质结合，又能与染料结合，故可增强着色能力；同时固定剂能沉淀和凝固细胞内成分，使细胞内成分产生不同的折光率，造成光学上的差异，使得原本看不清的结构变得清晰起来，所以，组织固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因。②存放标本的固定液浓度不宜过高或过低，浓度偏低，在正常固定时间内蛋白质沉淀和凝固必然不充分，使细胞内成分产生的不同折光率差异不够显著，原来看不清楚的结构也就不能清晰起来。而且由于浓度低、固定不足，其媒染效果也差，故易出现切片模糊不清现象。浓度过高，对蛋白质沉淀和凝固作用太强，使组织表面迅速变硬，减弱了固定液对组织的渗透能力，造成组织中间部分固定不佳，甚至达不到固定目的，亦易出现切片模糊不清现象。补救方法：可换成正常的固定液重新固定。③在送检的标本中，有时临床科用乙醇固定组织，常温下，乙醇沉淀的白蛋白、球蛋白不再溶于水，而核蛋白则可再溶于水，因此，造成乙醇固定的标本，切片核染色不良，胞质染色也较差，切片出现模糊不清现象。补救方法：用4%中性甲醛对标本再固定。④在日常病理制片工作中，经常发现淋巴组织(淋巴结、鼻咽部组织及扁桃体等)由于处理不当造成切片染色后组织间出现发灰现象，其主要原因可能是由于其细胞密集、结构复杂，导致固定液较难渗透到组织深部，从而造成组织中央固定不佳，而出现切片发灰现象。可用等量无水乙醇乙醚混合液处理切片5～10min，95%乙醇、80%乙醇洗，水洗，3%硫酸铁铵溶液补充媒染5min。3.3温度包埋时如果温度过高或切片后烤片温度过高，均会使组织蛋白质发生质变，可能发生拒染，造成切片染色模糊不清。3.4脱蜡切片脱蜡不彻底造成不着色或着色很淡，镜检时切片呈模糊不清。3.5染料染料质量差或染液配制失当，如配制苏木精时加热使氧化过度，不能生成三氧化苏木红，生成四氧化苏木红，使染液没有染色能力；或苏木精使用时间过久，导致切片着色不良，切片模糊不清。3.6分化过度胞核、胞质着色较淡，致切片模糊难辨。3.7脱水、透明不彻底 切片如在二甲苯中有白雾现象发生即表示乙醇脱水未尽，应退回乙醇重新脱水；否则，肉眼切片呈云雾状，镜下所见组织结构则模糊不清。3.8封固①要注意避免口、鼻呼出的气体接触组织切片上的封固剂，因呼出的气体中含有水分，②在潮湿(阴雨天)的环境里封片动作必须迅速，以避免空气中的水分进入封固剂内，影响切片质量。4、切片污染的原因4.1 组织碎屑污染在整个制片过程中，应避免将一种组织混入到另一种组织中，造成不应有的差错。4.2 染液及试剂污染 染液中的色素颗粒及试剂的沉渣或污物在染色时均可致切片被污染，如常见的苏木精沉渣。苏木精沉渣是指苏木精在氧化剂的作用下染液表面形成的一层氧化膜和在媒染剂的作用下形成的氢氧化铝结晶。新配制的苏木精染液使用一段时间后经常有结晶析出，染色过程中附着在组织上(特别是含有黏液的组织)影响病理诊断。采用下面方法可避免苏木精沉渣产生：①定期用滤纸过滤陈旧苏木精染液；②切片脱蜡至水，入1%碳酸氢钠水溶液处理，而后用陈旧苏木精染液染色；③每次染色前，用旧报纸将染液表面的氧化膜捞掉。4.3 灰尘污染 组织切片在染色前及染色时，均可能被灰尘污染。5、染色困难的原因染色困难是指组织切片在染色时着色淡或不易着色。其原因多为组织用酸性甲醛固定或组织在甲醛中固定时间过久所致。甲醛暴露于日光或与空气接触久置后，甲醛自行分解产生甲酸，而使溶液呈酸性影响伊红染色，严重时可影响细胞核着色。解决方法:①防止甲醛自行分解，在备用甲醛中加入适量的碳酸镁或碳酸钠,或用大理石作为中和剂，②固定时，建议用磷酸缓冲液配制的中性甲醛或弱碱性甲醛固定组织，必要时，还可采取二次固定。如以上措施效果不佳，再采用以下补救措施：①脱水前将组织用自来水冲洗12h；②染色时，组织切片脱蜡后流水冲洗12h；③问题严重的，用1%碳酸锂水溶液等弱碱性溶液浸泡组织数小时或过夜，再用自来水洗，以利于染色；④甲醛固定较久的组织切片在进行常规染色和特殊染色着色欠佳时，切片染色前用5%重铬酸钾水溶液处理切片30min，水洗后再染色,可使染色效果得到一定改善；⑤苏木精染料是一种有色的有机化合物，若无媒染剂存在时对组织的亲和力很小，但在媒染剂的作用下具有很强的染色能力。根据此原理，对染色困难的组织切片染色前采用3%硫酸铁铵溶液进行补充媒染，这样可以加强组织细胞与苏木精染液的亲和力，利于细胞核的着色；⑥延长苏木精的染色时间，加强苏木精与细胞核的结合力。6、切片易褪色的原因制成的组织切片，其染色结果有的能持久保存，有的则易褪色，其常见原因可归纳为两大类：①染料的性质及染料与组织的作用，染料与组织所形成的色淀结合牢固，其染色结果就能永久保持；②制片过程中的原因致切片易褪色。6.1 组织处理不当 ①固定不佳或固定时间过久(酸化)，固定液pH值不适宜；②固定较久的组织，特别是用含铬酸、重铬酸钾及锇酸等固定的组织，脱水前未将组织内部的固定液经流水彻底冲洗除去，影响了细胞核染色和保存。6.2 染色前处理失当6.3 染色时处理失当 染液及所用试剂酸碱度不适宜是一个很常见的重要原因。如HE染色时，用碱性过大的溶液返蓝，就易引起胞质褪色，而用pH7.5～8的弱碱性溶液返蓝并经自来水彻底冲洗，就不易引起切片褪色。在配制伊红染液中，若加入促染剂冰醋酸过多，染液混浊甚至沉淀，短时间就失效不能再用，染色结果保持时间很短，染色后切片极易褪色。因此每ml伊红染液加1～2滴冰醋酸较好，如摇动有大量泡沫浮在液面较长时间不消失，说明染液内冰醋酸过多，反之，泡沫少很快消失。6.4 染色后脱水、透明失当6.5 封固剂酸化 封固剂多用二甲苯作为溶剂，时间过长时其中的二甲苯逐渐氧化，生成苯甲酸和邻苯二甲酸而呈酸性，可导致苏木精褪色。故封固剂的酸碱度要适宜，尽量应用中性封固剂。我们在封固剂中放少量大理石或无水碳酸钠，置低温干燥箱内，充分搅拌待澄清后，取上清液备用较好。6.6 封固时天气潮湿 多雨、湿气浸入、组织切片内混入水分含有气泡、封固剂较稀或用量少、盖片小或不平、盖片位置不适当或被移动等，不但可致切片染色模糊不清，而且切片易褪色。6.7 染色后长期光照 封固剂及切片长期置于日光或强烈灯光下，尤其是暴晒于日光下，易引起氧化变酸致切片褪色。另外，将封固后的切片加温烤干或室温过高时，均能加速封固剂氧化，易引起切片褪色。6.8 载、盖玻片处理不当 不呈中性。7、HE染色组织切片中的类色素样颗粒此种颗粒也称空气色素颗粒，一般散在或成片状，圆形或不规则形，易被误认为黑色素或甲醛色素沉着。其分布无规律，可在任何组织切片中出现，但肝组织中更易出现。主要原因：①切片染色后封固时，切片中的二甲苯已完全挥发或切片不经过二甲苯透明，此时树胶不能完全封固切片，而形成干燥的空气气泡或腔隙；②树胶中含有水分；③树胶封固剂过稀，封固当时切片内并不出现黑点，当封固剂干燥或待二甲苯挥发后切片内可出现小黑点；④树胶浓度过高，流动不均匀，滴加的封固剂不能完全覆盖切片；⑤切片脱水、透明不彻底。解决方法：①切片染色后，经过石碳酸-二甲苯混合液(1∶3)处理或纯二甲苯充分透明后再用树胶封固，可防止该色素颗粒产生；②调整树胶浓度，可湿封固。8、HE染色组织切片中似细小水珠样杂质主要分布在腺体周围。许多人认为此杂质是水珠，是否为水珠，要看切片在高倍显微镜下是否清楚，若组织细胞结构清晰，就不是脱水不净，可能是封固时切片干涸而造成的细小气泡所致。解决方法：①脱水不净应乙醇重新脱水；②切片干涸应重新在二甲苯中脱胶后再封固。9、产生气泡的原因①切片厚薄不均搓板样、切片不平整、胶液扩散不均所致；②展片水温过低组织未展开或水底产生的气泡浮在组织上，脑组织等在捞片时组织下面亦易产生气泡；③封固胶过稀或过稠；④封固时操作不当。盖玻片先一侧置于滴有胶液的组织上，然后缓慢放下可解决此问题。预览时标签不可点
本文编辑：佚名
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