一：实验概述
免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。
二、免疫组化技术的优点
1
特异性强
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白(keratin)显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2
敏感性高
在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍;现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3
定位准确
该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的
三：实验步骤
1、脱蜡
烤片：30min--1h（石蜡切片62℃）
机洗：约45min
去离子水清洗3次，每次2min/
2、抗原修复
柠檬酸钠（又名枸橼酸钠）缓冲液（约需ml），微波炉中高火加热至沸腾（火力3min）
加入标本，中高火（火力）加热8-10min，中低火（30火力）加热3min
冷却至室温（此时打开温箱调至37℃）
PBS清洗3次，每次2min
注：
中高火加热时，水蒸气沸腾，蒸发，所以盖子不能盖紧，防止压力过大，为避免干片，加热中途可在玻片盒中再加入适量缓冲液（目前实验室常用方法为火力加热6min后，在玻片盒中再加入适量缓冲液，继续火力加热1min）。
（抗原修复还有电饭锅煮沸法：即提前预热电饭锅，将水烧开，放入玻片盒水浴15min，电饭锅煮沸法不会导致干片，但丁香园推荐使用微波炉进行抗原修复，这一点大家可以自己摸索）
3、取出
取出玻片，用免疫组化油笔在组织周围画圈，与组织大约距离2mm，再滴加约50ulH覆盖组织（阻断内源性过氧化物酶），37℃温箱湿盒孵育15min。
PBS清洗3次，每次2min
4、封闭
滴加约50ul5%BSA（PBS或TBS配置）覆盖组织，37℃温箱湿盒孵育30min。
5、孵育
一抗4℃孵育过夜，（同一组织应制备阴性对照组，即孵育一抗时孵育PBS，其他步骤相同）
6、复温
从4℃冰箱中取出，室温复温。
PBS清洗3次，每次2min
7、滴液
滴加反应增强液50ul，覆盖组织，37℃温箱湿盒孵育20min。
PBS清洗3次，每次2min
8、二抗
二抗37℃温箱湿盒孵育30min（配置DAB显色液＊危险试剂，避光）。
PBS清洗3次，每次2min
注：
有的试剂盒要求先加二抗，再加反应增强液，（即第7步和第8步步骤颠倒，应仔细阅读试剂盒说明书，目前询问和查阅发现博士德公司试剂盒的DAB染色液不是很好用，可自行购买DAB染色液）
9、显色
DAB显色液50ul覆盖组织，滴加DAB显色液后可放在一张白纸上，用于观察颜色，方便对比，DAB显色液一般将组织染至深棕色后用去离子水洗片（终止DAB反应），5min3次；若DAB染色不理想可适当延长反应时间，但一般不超过15min（15min后仍无明显深棕色染色，延长反应时间并无较大意义）。
10、染色
苏木素染色液孵育10-15秒，（应根据苏木素的利用次数决定孵育时间，新使用的苏木素孵育时间应缩短，随着使用次数增加孵育时间），染好后立即取出，流水冲洗玻片背面至水变清为止
11、水浸
水浸3min（无特殊要求，自来水即可）
12、乙醇
无水乙醇浸泡3min
13、二甲苯
二甲苯浸泡5min
14、封片
自动封片机封片
15、拍照
晾干后观察，拍照
Tips;
1：DAB显色液为危险试剂，需避光
2：苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。
3：一抗孵育最好在4度过夜
4：注意时间统筹，如在第三步用免疫组化油笔在组织周围画圈时，可打开温箱，因为温箱开机到达到预定温度需要一段时间。
5：所有步骤均要遵循的原则：不能干片（除非实验步骤中有要求干片）。
参考文献：
中国化工仪器网《免疫组化方法的优点和缺点》
生物学霸
本文编辑：佚名
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