摘要：目的比较救必应总三萜主要成分在正常和高脂血症大鼠体内的药动学行为。方法SD大鼠随机分为正常组和模型组，模型组制备高脂血症大鼠模型，各组单次ig救必应总三萜后于不同时间点取血。采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）测定大鼠血浆中冬青苷O、oblonganosideI、rotundinosideC、ilexsideII、长梗冬青苷、苦丁冬青苷H、毛冬青皂苷A1、竹节参皂苷IVa、救必应酸、rotundanonicacid、冬青素A的浓度，将血药浓度和时间数据导入DAS2.0软件中以非房室模型拟合药动学参数。结果苷元的吸收速度显著高于三萜皂苷，皂苷含糖的数目越多吸收入血的速度越慢。救必应酸在正常和高脂血症大鼠体内的达峰浓度（Cmax）分别为.9、.8nmol/L，药-时曲线下面积（AUC0～t）分别为.6、.3nmol·h/L，远超其他10个成分的总和。与正常组相比，模型组大部分成分的达峰时间（tmax）延长，Cmax、AUC0～t降低。结论救必应总三萜主要成分在正常和高脂血症大鼠体内的药动学行为存在显著差异，救必应酸为口服总三萜后大鼠体内的主要暴露成分。
救必应为铁冬青IlexrotundaThunb.的干燥树皮，是岭南地区常用中药材，收载于《中国药典》年版，常用于治疗心脑血管和消化系统疾病[1]。三萜是救必应的特征性组分，在70%乙醇提取物中的含量超过45.0%。总三萜为救必应治疗心脑血管疾病的活性部位，具有较好的临床应用价值[1-3]。口服药物发挥作用有2个重要的前提条件，一是能够入血吸收且具有较高的暴露量和较长时间地维持起效浓度，二是能够以原型或代谢产物的形式到达靶器官[4]。由于中药所含成分相对复杂，口服给药后可能是关键成分或组分发挥药效，这些关键成分或组分是后续药效学研究的重点[4]。因此，开展中药多成分药动学研究是揭示中药药效物质基础的重要环节。机体处于疾病状态时，与药物吸收、代谢、排泄相关的因素较正常状态存在较大改变，从而影响口服给药后其活性成分的药动学行为[5-6]。目前已有文献报道了救必应中长梗冬青苷和救必应酸在正常大鼠体内的药动学研究[7-9]，本课题组前期也报道了正常大鼠单次ig救必应提取物后6个三萜类成分（冬青苷O、rotundinosideC、长梗冬青苷、救必应酸、rotundanonicacid、冬青素A）的药动学行为[10]。鉴于救必应一般应用于病理状态下，且总三萜为其发挥调血脂作用的活性部位，因此研究救必应总三萜在疾病状态下的药动学行为更具有实际意义。本研究在前期工作的基础上，建立了测定大鼠血浆中11个救必应特征性三萜（冬青苷O、oblonganosideⅠ、rotundinosideC、ilexsideⅡ、长梗冬青苷、苦丁冬青苷H、毛冬青皂苷A1、竹节参皂苷IVa、救必应酸、rotundanonicacid、冬青素A）的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，并考察了以上成分在单次ig救必应总三萜的正常和高脂血症大鼠中的药动学行为，以期为救必应的调血脂药效物质基础研究、新药开发和临床用药安全提供参考。1材料
1.1动物
SPF级雄性SD大鼠20只，4～6周龄，体质量～g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号25。动物饲养于实验动物中心屏障环境中，动物室温度为（23±3）℃，相对湿度为（50±5）%，光照周期为12h亮/12h暗。动物实验经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准号）。1.2药材
救必应药材（批号）购自广州至信中药饮片有限公司，经广州中医药大学赵钟祥教授鉴定为冬青科植物铁冬青I.rotundaThunb.的干燥树皮。1.3药品与试剂
对照品地高辛（批号wkq，质量分数大于99.0%）购自维克奇科技有限公司；冬青苷O（1）、oblonganosideⅠ（2）、rotundinosideC（3）、ilexsideⅡ（4）、长梗冬青苷（5）、苦丁冬青苷H（6）、毛冬青皂苷A1（7）、竹节参皂苷Iva（8）、救必应酸（9）、rotundanonicacid（10）、冬青素A（11）为本课题组前期从救必应中分离并鉴定，质量分数均大于98.0%，化学结构式见图1；色谱级乙腈、甲醇购自德国Merck公司；质谱级甲酸购自美国ThermoFisherScientific公司；其他试剂均为分析纯；普通饲料购自广州中医药大学实验动物中心；SPF级高脂饲料购自广东省医学实验动物中心。1.4仪器
TripleTOF?＋质谱仪（美国ABSciex公司）；LC-30A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；真空离心浓缩仪（德国Eppendorf公司）；高速冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；RM半自动轮转式切片机（德国Leica公司）；cobas全自动生化分析仪（瑞士Roche公司）。2方法
2.1救必应总三萜的制备
取救必应药材10.5kg，粉碎后以75L70%乙醇加热回流提取2h，提取4次，减压浓缩干燥后得总提取物g。取总提取物g经大孔树脂分离，依次用75L蒸馏水、50L25%乙醇、50L75%乙醇和50L95%乙醇梯度洗脱，回收75%乙醇洗脱液得g总三萜，测得总三萜中化合物1～11的质量分数分别为2.26、3.13、3.04、7.06、.70、7.75、0.91、8.86、.29、2.49、1.76mg/g。2.2对照品溶液及内标溶液的制备
精密称取化合物1～11对照品适量，分别用色谱级甲醇配制成质量浓度为0.1、0.1、0.1、0.1、2.0、0.5、0.1、0.5、2.0、0.1、0.1mg/mL的单一对照品储备液，临用前配制成系列质量浓度的混合物对照品工作液。取地高辛对照品适量，精密称定后用色谱甲醇配制成质量浓度为0.02mg/mL的储备液，临用前稀释成质量浓度为0.1μg/mL的内标溶液。2.3色谱和质谱条件
2.3.1色谱条件WatersUPLCBEHC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm），流动相为0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～1.0min，25%～30%A；1.0～3.5min，30%A；3.5～7.0min，30%～35%A；7.0～9.0min，35%～49%A；9.0～11.0min，49%～63%A；11.0～12.0min，63%～70%A。柱温为50℃；体积流量为0.4mL/min；进样量为5μL。
2.3.2质谱条件ESI离子源；于负离子、选择反应监测扫描模式下采集数据；雾化气和辅助加热气压力为.kPa；气帘气压力为.kPa；喷雾电压为?V。11个成分和内标优化后的离子对和碰撞能参数见表1。
2.4动物分组与造模
20只SD大鼠适应性饲养1周后随机分为正常组和模型组，正常组给予普通饲料，模型组给予高脂饲料，造模期间自由饮水。6周后采集正常和模型组大鼠血清，测定三酰甘油（triglycerides，TG）、总胆固醇（totalcholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）水平，结合肝脏苏木素-伊红（HE）染色（每组3只）评价高脂血症大鼠模型是否成功建立。
2.5药动学研究
造模成功后，大鼠禁食12h，自由饮水。总三萜临用前以4%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成混悬液，各组大鼠单次ig救必应总三萜（1.2g/kg），ig体积为10mL/kg。于给药前（0h）及给药后0.08、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00、48.00h经眼眶后静脉丛取血0.5mL，血样采集后置于肝素预处理的EP管中，立即于4℃、r/min离心10min，吸取上层血浆，于?80℃保存待测。2.6血浆样品的处理
取μL自然融化的血浆，加入μL色谱级甲醇和μL内标溶液，涡旋3min，00r/min离心10min，取上清液真空浓缩干燥，残渣用μL色谱级甲醇（含0.1%甲酸）复溶，00r/min离心10min，取上清液进样分析。2.7方法学考察
2.7.1专属性试验取空白血浆、空白血浆＋定量限质量浓度对照品、给药血浆样品，按“2.6”项下方法处理后进样分析，提取各样品的离子流图。
2.7.2线性关系与灵敏度试验在空白大鼠血浆中加入适量系列质量浓度的混合对照品工作液，使化合物1～4、6～8、10、11的终质量浓度为.00、.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13ng/mL，化合物5的终质量浓度为.00、.00、.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13ng/mL，化合物9的终质量浓度为0.00、0.00、.00、.00、.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91ng/mL，按“2.6”项下方法处理即得标准曲线样品，进样分析，以待测成分和内标峰面积的比值为纵坐标（Y），待测成分的质量浓度为横坐标（X），进行线性回归（权重为1/x2）。另取混合对照品溶液稀释，按“2.6”项下方法处理后进样分析，以信噪比10作为定量限。
2.7.3精密度与准确度试验在空白大鼠血浆中加入适量的混合对照品工作液，使化合物1～4、6～8、10、11的终质量浓度为.00、.00、3.13ng/mL，化合物5的终质量浓度为.00、.00、6.25ng/mL，化合物9的终质量浓度为0.00、.00、7.81ng/mL，按“2.6”项下方法处理即得高、中、低质量浓度的质控样品，平行制备各质量浓度的质控样本各6份，进样分析，连续进样3d考察日内和日间的精密度和准确度。
2.7.4稳定性试验制备高、中、低质量浓度的质控样本各6份，进行?80℃储存30d、25℃放置4h、反复冻融3次试验，进样分析，计算各成分的质量浓度。
2.7.5基质效应和提取回收率试验取适量超纯水（A）和空白血浆（B），按照“2.6”项下方法处理后，加入“2.2”项下系列质量浓度的对照品工作液，制备相当于质控样品质量浓度（高、中、低）的样品。另取适量空白血浆，按照“2.6”项下方法制备高、中、低3个质量浓度的质控样品（C），进样分析。以相同质量浓度样品C与B的峰面积比值计算提取回收率，B与A的峰面积比值计算基质效应。
2.8数据分析与处理
采用DAS2.0软件计算药动学参数，GraphPadPrism7软件绘制血药浓度-时间曲线。计量资料以表示，采用SPSS20.0软件进行统计学分析。首先进行正态性检验，对于不满足正态分布的两组计量资料之间的比较采用Mann-WhitneyU检验；对于满足正态分布的两组计量资料之间的比较采用两独立样本t检验。3结果
3.1高脂血症大鼠模型的评估
如图2-A所示，与正常组比较，模型组大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平显著升高（P＜0.01），HDL-C水平显著降低（P＜0.01）。如图2-B所示，模型组大鼠肝脏细胞体积较正常组肿大，呈网状或蜂窝状，胞质内有大量油脂滴堆集，形成脂肪空泡样病变，提示大鼠高脂血症模型建立成功。
3.2方法学考察
3.2.1专属性试验如图3所示，内源性成分不干扰目标成分和内标的检测，表明方法专属性良好。
3.2.2线性关系与灵敏度试验11个成分的标准曲线、相关系数、线性范围、定量限结果见表2，表明各成分的线性关系良好、灵敏度较高。
3.2.3精密度与准确度试验如表3所示，11个成分的精密度和准确度符合生物样品的测定要求，日内和日间精密度的相对偏差分别小于12.6%、13.5%，日内和日间准确度的相对误差分别为?14.9%～12.3%、?13.0%～13.0%。
3.2.4稳定性试验如表4所示，11个成分在上述条件下的稳定性良好，相对偏差小于15.0%，准确度为?14.8%～14.7%。
3.2.5基质效应和提取回收率试验如表3所示，该方法符合生物样品分析时对提取回收率和基质效应的要求，11个成分的提取回收率为86.0%～.1%，相对偏差小于14.7%；基质效应为85.7%～.5%，相对偏差小于14.2%。
3.3血药浓度-时间曲线和主要药动学参数
测定11个成分在正常和模型组大鼠给药后各时间点的血药浓度，将所得数据导入DAS2.0软件以非房室模型和统计矩方法拟合药动学参数。主要药动学参数见表5，血药浓度-时间曲线见图4。
4讨论
4.1优化样品制备及分析方法
本研究考察了固相萃取、甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白法处理血浆样品时对11个成分选择性、基质效应和提取回收率的影响，结果表明固相萃取法的选择性和降低基质效应的效果最好，但是提取回收率低于甲醇或乙腈沉淀蛋白法。考虑到固相萃取法操作较为繁琐和费时，且样品数量较多，因此首先排除固相萃取法。甲醇或乙腈沉淀蛋白法虽然基质效应高于固相萃取法，但是其重复性和提取回收率相对较好，且处理后样品中的内源性物质未对11个成分和内标的测定造成干扰，满足药动学研究的要求。考虑到乙腈的毒性和成本，最终选择甲醇沉淀蛋白法作为本研究血浆样品处理方法。本研究考察了不同流动相（乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸甲醇溶液-0.1%甲酸水溶液）、不同色谱柱（WatersUPLCHSST3C18色谱柱（mm×2.1mm，1.8μm）以及WatersUPLCBEHC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm）、不同体积流量（0.3、0.4mL/min）对11个成分和内标分离度与响应的影响，结果表明当选用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液、WatersUPLCBEHC18色谱柱、体积流量为0.4mL/min时各成分的分离度和响应最好，特别是同分异构体1和3能够在较短的时间内达到基线分离。本研究采用选择反应监测扫描模式，并采用针泵进样对照品溶液优化了相应的质谱条件。11个成分均为三萜，且部分结构中含有1～3个糖分子，根据相关文献[11]报道选择地高辛作为内标。4.2药动学行为分析
本研究中的总三萜给药剂量是根据《中国药典》年版救必应饮片成人用药剂量换算所得，11个三萜成分在正常和模型组大鼠大部分时间点的血浆样品中均能够检测到。11个成分根据结构中含糖的数目可以分为5类：苷元（9～11）、单糖苷（5、7）、双糖苷（2、6、8）、三糖苷（4）、四糖苷（1、3）。如图4所示，部分成分的血药浓度-时间曲线呈现了明显的双峰现象，推测可能是由于肝肠循环、小肠吸收时的不均匀性或给药剂量偏大等因素引起的[12]。正常组大鼠单次ig救必应总三萜后苷元的达峰时间（tmax）为0.8～1.1h，单糖苷的tmax为1.5～2.0h、双糖苷的tmax为1.9～2.6h、三糖苷的tmax为2.8h、四糖苷的tmax为3.1h，提示在正常情况下苷元通过小肠吸收入血的速度明显快于皂苷，且皂苷含糖的数目越多吸收的速度越慢，与本课题组前期报道的正常大鼠单次ig救必应提取物（2.0g/kg）后测定的6个特征性成分（1、3、5、9～11）的tmax结果和规律基本一致[10]。正常组中11个成分的达峰浓度（Cmax）和药时曲线下面积（AUC0～t）与其在总三萜中的含量和化学结构相关，化合物1～4、6～8、10、11的Cmax和AUC0～t分别为34.1～.4nmol/L、.3～.6nmol·h/L，化合物5（长梗冬青苷）的Cmax和AUC0～t分别为.8nmol/L和.1nmol·h/L，化合物9（救必应酸）的Cmax和AUC0～t分别为.9nmol/L和.6nmol·h/L。长梗冬青苷和救必应酸在总三萜中的质量分数分别为22%、18%，差别不大，但救必应酸的Cmax和AUC0～t分别是长梗冬青苷的9.0、9.5倍。前期研究[10]也得出了类似的结论，可能是因为救必应酸作为苷元更容易吸收入血，长梗冬青苷等以救必应酸为苷元的救必应三萜类成分能够在肠道菌群的作用下代谢转化为救必应酸[13-14]，在一定程度上增加了救必应酸的给药浓度。11个成分在高脂血症大鼠中的主要药动学参数的变化规律同正常组基本一致。苷元的入血吸收速度显著快于皂苷，救必应酸为ig总三萜后血浆中的主要暴露成分，且救必应酸的Cmax和AUC0～t远超其他10个成分的总和。与正常组相似，虽然总三萜中救必应酸和长梗冬青苷的含量相差不大，但模型组中救必应酸的Cmax和AUC0～t分别是长梗冬青苷的9.7、11.9倍。与正常组相比，除化合物4外，模型组其他10个成分的tmax均不同程度地延后；除化合物3和8外，模型组其他9个成分的Cmax均不同程度地降低，化合物4～7、9和10有统计学差异；除化合物1和3外，模型组其他9个成分的AUC0～t均不同程度地降低，化合物2、5～7、9～11有统计学差异。本课题组前期研究表明肠道菌群有助于救必应三萜类成分吸收入血[13]，高脂血症大鼠的肠道菌群处于失衡状态，菌群结构和相关酶的活力较正常状态存在较大改变，因此疾病状态对救必应三萜类成分的吸收入血速率和程度可能存在较大的影响。另外，与正常大鼠相比，高脂血症大鼠的脂肪肝样病变可能影响药物的代谢和排泄，肠道中胆汁酸的分泌增加可能干扰药物的吸收，以上因素可能最终导致部分三萜类成分的tmax、Cmax、AUC0～t不同程度地延长或降低。综上，救必应总三萜主要成分在正常和高脂血症大鼠体内的药动学行为存在显著差异，苷元入血吸收的速度明显快于皂苷，且含糖的数目越多吸收入血的速度越慢。救必应酸为ig总三萜后血浆中的主要暴露成分，Cmax和AUC0～t远超其他10个成分的总和，推测救必应酸可能是救必应总三萜发挥心脑血管活性的关键成分。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：杨宝，郑小芸，轩申鑫，阮清锋，江诗琴，崔辉，赵钟祥．救必应总三萜主要成分在正常和高脂血症大鼠体内的药动学比较[J].中草药,,52(13):-.
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