摘要：目的研究长片金线兰多糖的结构特征以及对四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法从长片金线兰中提取多糖，分析其相对分子质量、单糖组成、紫外与红外吸收特征。将48只ICR小鼠随机分为对照组、模型组、联苯双酯（mg/kg）组和长片金线兰多糖低、中、高剂量（、、mg/kg）组，给予相应药物干预9d后，除对照组外，其余各组ipCCl4造成急性肝损伤，16h后检测各组小鼠血清中丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartateaminotransferase，AST）和乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）活性；测定各组大鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性以及谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用苏木素-伊红（HE）染色法观察各组小鼠肝脏组织病理变化。结果长片金线兰多糖的相对分子质量为4.×，由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成（物质的量比为1∶0.11∶0.19∶11.15∶0.87∶0.36∶0.18），紫外与红外光谱扫描结果推测其可能为一种吡喃型杂多糖。与模型组比较，长片金线兰多糖能够显著降低CCl4致肝损伤小鼠血清中ALT、AST和LDH活性（P＜0.05、0.01），提高肝脏组织中SOD、CAT活性和GSH含量（P＜0.05、0.01），降低MDA含量（P＜0.01），减轻CCl4对肝组织的病理损伤。结论长片金线兰多糖对CCl4致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制脂质过氧化有关。
金线莲是福建特色中草药，来源于兰科金线兰属植物金线兰Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.的全草，具有清热凉血、祛风利湿、解毒等功效[1-2]。金线莲多糖为金线莲中主要的活性成分，含量占金线莲药材生药量的10%左右[3]。现代药理学研究表明，金线莲多糖具有保肝、降血糖、免疫调节、抗氧化、抗类风湿性关节炎等活性[4-7]。长片金线兰A.longilobusH.JiangetH.Z.Tian也是金线兰属植物，其植物形态和金线兰、台湾银线兰A.formosanusHayata等金线兰属植物较为相似[8-9]，本课题组在前期金线莲野生资源调查过程中发现长片金线兰在云南等地一直被当作金线莲使用。目前关于长片金线兰多糖的结构特征和药理活性尚未见报道，本研究旨在分析长片金线兰多糖的结构特征并探讨长片金线兰多糖对四氯化碳（CCl4）诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用，以期为金线莲药用新资源的发掘提供科学依据。
1材料
1.1动物
清洁级雄性ICR小鼠48只，5周龄，体质量18～20g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）-。动物于福建中医药大学药学院适应性饲养1周，温度24～26℃，相对湿度50%～70%，昼夜循环正常，自由进食饮水。动物实验遵循福建中医药大学药学院实验动物管理和使用规定，符合3R原则。
1.2药材
长片金线兰购自福建漳州，经福建中医药大学药学院吴岩斌副研究员鉴定为兰科金线兰属植物长片金线兰A.longilobusH.JiangetH.Z.Tian的全草。
1.3药品与试剂
苯酚（批号T20331）购自国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸（TFA，批号L）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批号i）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸铵（批号0420）购自天津市致远化学试剂有限公司；葡萄糖对照品（批号DAS，质量分数＞98%）购自大连美仑生物技术有限公司；鼠李糖对照品（批号，质量分数＞98%）购自士锋生物科技有限公司；木糖对照品（批号118-404，质量分数＞98%）购自中国食品药品检定研究院；对照品葡萄糖醛酸（批号K14J7S）、半乳糖醛酸（批号S29J8I）、半乳糖（批号Z20O7H）、阿拉伯糖（批号Z29O7H）购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均大于98%；联苯双酯滴丸（批号）购自北京协和药厂；丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase，ALT）检测试剂盒（批号）、天冬氨酸转氨酶（aspartateaminotransferase，AST）检测试剂盒（批号）、乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）检测试剂盒（批号）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（批号）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）检测试剂盒（批号）、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒（批号）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号）购自南京建成生物工程研究所；色谱级乙腈购自德国Merck公司；其他试剂均为分析纯。
1.4仪器
多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；DAWNHELEOSII型18角度激光光散射仪（美国Wyatt公司）；RI-型示差检测器（日本Shodex公司）；UV-紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；Nicoletis5傅里叶红外光谱仪（美国ThermoFisherScientific公司）；高效液相色谱仪（HPLC，美国Agilent公司）；DM0BLED生物显微镜、RM型石蜡切片机（德国Leica公司）。
2方法
2.1长片金线兰多糖的制备
长片金线兰全草干燥至恒定质量，粉碎后加入30倍量80%乙醇回流提取2h，药渣加入15倍量蒸馏水，90℃提取3次，2h/次；合并水提液，滤过，滤液浓缩至一定体积，加入无水乙醇至乙醇质量分数达到80%，4℃静置12h，离心，弃去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤后以蒸馏水溶解，透析，冷冻干燥，备用。
2.2长片金线兰多糖中总糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[10]测定长片金线兰多糖中总糖的含量，以葡萄糖为对照品绘制标准曲线。
2.2.1标准曲线的绘制精密称取葡萄糖对照品10mg于mL量瓶中，加蒸馏水定容，得到质量浓度为μg/mL的溶液，即得对照品溶液。精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL对照品溶液，加蒸馏水补足1mL，精密加入5%苯酚溶液1mL，混合摇匀，再精密加入5mL硫酸，摇匀，沸水浴加热20min，取出，至冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，测定nm处的吸光度（A）值，以A为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。
2.2.2样品含量测定精密称取长片金线兰多糖5mg于mL量瓶中，加蒸馏水定容，照标准曲线制备项目下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL”起，依法测定A值，根据标准曲线得出供试品的无水葡萄糖的量，计算，即得。
2.3长片金线兰多糖相对分子质量的测定
参照文献报道方法[11]，采用凝胶排阻色谱联用多角度激光光散射和示差折光仪法（SEC-MALLS-RI）测定长片金线兰多糖的相对分子质量。取长片金线兰多糖5mg，用流动相配制成终质量浓度为2.5mg/mL的供试品溶液，经0.22μm滤膜滤过，备用。色谱条件：TSKGelGPWXL色谱柱（mm×7.5mm，10μm）串联TSKGelG0PWXL色谱柱（mm×7.5mm，6μm）；流动相为0.1mol/LNaCl溶液；色谱柱柱温为35℃；体积流量为0.35mL/min；进样量为1mL；采用Astra6.1软件采集及处理数据。
2.4单糖组成分析
2.4.1单糖混合对照品溶液的制备精密称取对照品甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖各5mg，分别加水定容至2mL。精密量取各对照品溶液μL，混匀，即得混合单糖对照品溶液。
2.4.2多糖水解和衍生化产物的制备精密称取长片金线兰多糖10mg于具塞试管中，加入1mL蒸馏水溶解，再加入1mL3mol/L三氟乙酸，混匀，封口后于℃水解2h；冷却至室温，用3mol/LNaOH溶液中和至pH7.0，蒸馏水定容至5mL，得到长片金线兰多糖水解液。精密吸取混合单糖对照品溶液和长片金线兰多糖水解液各μL，分别加入0.3mol/LNaOH溶液μL、0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液μL，于70℃水浴反应min；取出后冷却至室温，加入μL0.3mol/LHCl溶液中和，再加入μL蒸馏水，混合均匀后，加入1mL氯仿涡旋萃取3次，收集水层溶液，经0.22μm滤膜滤过，用于HPLC分析，并绘制各单糖的标准曲线方程，计算单糖含量。
2.4.3色谱条件参照文献报道的色谱条件[12]，采用InertsilODS-SPC18色谱柱（mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.1mol/L醋酸铵溶液（B），梯度洗脱：0～20min，17%～19%A；20～60min，19%A；二极管阵列检测器（DAD）检测器；检测波长为nm；柱温为30℃；体积流量为1mL/min；进样量为20μL。
2.4.4光谱分析
（1）紫外光谱分析：取多糖样品5mg于mL量瓶中，加水溶解，配制成质量浓度为0.5mg/mL的多糖溶液，以蒸馏水为空白对照，采用紫外可见分光光度计在波长～nm处进行光谱扫描。
（2）红外光谱分析：称取多糖样品1～2mg，与mg干燥溴化钾粉末研磨压片，采用红外光谱仪在0～cm?1处扫描。
2.5长片金线兰多糖对肝损伤小鼠的保护作用
2.5.1动物分组、造模与给药小鼠适应性饲养7d后，随机分为对照组、模型组、联苯双酯（mg/kg）组以及长片金线兰多糖低、中、高剂量（、、mg/kg）[4]组，每组8只。各给药组ig相应药物（10mL/kg），对照组和模型组ig等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续9d。
2.5.2血清生化指标的测定末次给药后2h，除对照组外，其余各组ip0.%CCl4花生油溶液（10mL/kg）致小鼠急性肝损伤。禁食不禁水16h，眼球取血，0r/min离心10min，分离血清，按试剂盒说明书测定各组小鼠血清中ALT、AST及LDH活性。
2.5.3肝脏组织中生化指标的测定小鼠脱颈椎处死，迅速摘除肝脏，取部分肝脏组织于研磨器中，加入0.9%氯化钠溶液，在冰浴中研磨，制备成10%肝组织匀浆，按试剂盒说明书测定各组小鼠肝脏组织SOD、CAT活性和GSH、MDA含量。
2.5.4肝组织病理学检查取肝脏部分左叶于4%多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色后，于显微镜下观察各组小鼠肝脏组织病理变化。
2.5.5统计学分析数据以表示，采用SPSS19.0软件进行统计，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。
3结果
3.1长片金线兰多糖中总糖的含量
以A值为纵坐标（Y），葡萄糖浓度为横坐标（X）进行线性回归，得到回归方程Y＝4.X＋0.，R2＝0.，线性范围为0.01～0.10mg/mL，测得长片金线兰多糖中总糖含量为88.79%。
3.2长片金线兰多糖的相对分子质量
长片金线兰多糖SEC-MALLS-RI图谱见图1，采用MALLS和RI检测器同时测定，通过计算可以直接得到样品中每个点的绝对分子质量，通过Astra6.1软件对结果进行处理，得到多糖重均相对分子质量为4.×，多分散系数为2.61。
3.3长片金线兰多糖的单糖组成特征
长片金线兰多糖的单糖组成及混合单糖对照品的HPLC图谱见图2。长片金线兰多糖为杂多糖，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7种单糖组成，其物质的量比为甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖＝1∶0.11∶0.19∶11.15∶0.87∶0.36∶0.18，其中以葡萄糖量最高，其次为甘露糖和半乳糖。
3.4长片金线兰多糖紫外和红外光谱分析
如图3所示，长片金线兰多糖在紫外光区～nm，A值呈下降趋势。长片金线兰多糖在、nm波长处无明显特征吸收峰，可见长片金线兰多糖中基本不含蛋白质和核酸，与金线兰多糖的紫外光谱特征相似[4]。
如图4所示，长片金线兰多糖在0～cm?1具有多糖类物质的一般特征峰，其中、cm?1分别为O-H和C-H吸收振动峰[4,13]；cm?1处的吸收峰可能是多糖样品中少量的束缚水引起的吸收[4,13]；、1cm?1处的吸收峰是由C-H键的振动引起的；、、cm?1为吡喃糖特征吸收峰[13]，cm?1为α-糖苷键的吸收峰[4]。
3.5长片金线兰多糖对肝损伤小鼠血清中ALT、AST和LDH活性的影响
如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST和LDH活性均显著升高（P＜0.01），表明CCl4致小鼠急性肝损伤模型成功建立；与模型组比较，长片金线兰多糖各剂量组小鼠血清中ALT、AST和LDH活性均显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.6长片金线兰多糖对肝损伤小鼠肝脏组织中SOD、CAT活性和GSH、MDA含量的影响
如图6所示，与对照组比较，模型组肝脏组织SOD、CAT活性及GSH含量显著降低（P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，长片金线兰多糖各剂量组肝组织中SOD、CAT活性和GSH含量显著升高（P＜0.05、0.01），MDA含量显著降低（P＜0.01）。
3.7长片金线兰多糖对肝损伤小鼠肝脏组织病理变化的影响
如图7所示，对照组小鼠肝板排列整齐，结构完整，肝细胞呈圆形，核居中，无坏死、变性和炎性浸润等现象；模型组肝索排列紊乱，细胞肿胀变形，胞质空亮，肝组织可见炎性细胞浸润、部分细胞核固缩、消失；与模型组比较，长片金线兰多糖各剂量组上述病理变化得到不同程度地改善，肝细胞肿胀变形、坏死程度明显减轻，表明长片金线兰多糖对CCl4致急性肝损伤有明显的保护作用。
4讨论
CCl4诱导的肝损伤动物模型已经广泛用于保肝药物的筛选[14-16]。本研究首次探究了长片金线兰多糖对CCl4致急性肝损伤小鼠的保护作用。研究表明，CCl4主要通过其自由基代谢物引起的氧化应激反应而导致肝细胞损伤。血清ALT、AST和LDH活性是评价肝功能损伤常用的标志物，血清中ALT、AST和LDH活性明显升高，提示肝细胞破坏、细胞膜通透性增加、线粒体损伤[17-18]。SOD和CAT是体内重要的抗氧化酶，能够清除机体产生的自由基，抑制体内脂质过氧化的进程[19]。GSH是一种非酶抗氧化剂，在抵御活性氧引起的细胞损伤方面具有重要的作用，GSH耗竭可导致脂质过氧化，引起肝细胞损伤[20]。MDA是肝细胞脂质过氧化的主要代谢产物之一，其水平可以反映肝细胞脂质过氧化和氧化应激的程度[17]。
本研究分析长片金线兰多糖结构特征并探讨其抗肝损伤活性，结果显示，长片金线兰多糖相对分子质量为4.×，为主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等单糖组成的杂多糖。长片金线兰多糖能够降低肝损伤小鼠血清中AST、ALT和LDH活性，提高肝组织中SOD、CAT活性和GSH含量，降低肝组织中MDA含量，表明长片金线兰多糖能够有效改善CCl4致急性肝损伤小鼠的肝功能，提高细胞清除自由基的能力，减轻细胞膜在自由基等攻击下的氧化损伤程度。
综上所述，长片金线兰多糖和金线兰多糖均具有保肝作用，而且长片金线兰多糖的主要单糖组成和金线兰多糖的单糖组成相同，但是长片金线兰多糖和金线兰多糖的糖苷键类型及连接顺序、高级构象等结构特征是否相同还尚不清楚。此外，关于长片金线兰其他类型的化学成分研究报道较少，是否与金线兰中的化学成分相似还有待进一步的研究。因此，长片金线兰能否作为金线兰的替代品，作为金线莲使用，尚有待于进一步研究。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：江颖倩，彭梦超，吴建国，吴岩斌，吴锦忠．长片金线兰多糖对四氯化碳诱导急性肝损伤小鼠的保护作用[J].中草药,,52(19):-.
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