第一章抗体与抗原
抗体(Antibody，Ab)，也称作免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，是血液和组织液中发挥免疫应答功能的一类糖蛋白。抗体是一种能特异性结合抗原的糖蛋白，是机体防御系统中重要的组成部分。
抗体的结构与特征
抗体的基本结构是一个Y型的四肽链，由完全相同的两条重链(heavychain，HC)和相同的两条轻链(lightchain，LC)组成。重链和轻链是根据他们分子量大小来命名的，其相对分子质量分别约为50-75kDa和25kDa。在结构上，重链和重链之间、重链和轻链之间以二硫键相连，结合成一个轻重链配对的对称分子。
抗体结构
重链和轻链
哺乳动物Ig的重链一共有5种，分别用希腊字母α、δ、ε、γ和μ命名，相对应组成的抗体就称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五种抗体。其中有一些类别还可以再分为亚类，例如人的γ链有四种：γ1、γ2、γ3、γ4，小鼠的γ链也有四种：γ1、γ2a、γ2b和γ3，少数品系的小鼠还有γ2c。每一个重链有两个区，分别称为可变区和恒定区。重链的可变区大约含有个氨基酸，可变区和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性。恒定区和抗体效应功能相关，同一类型抗体的恒定区组成上是相同的。
哺乳动物Ig轻链有两种类型，即λ型和κ型，但每一个抗体中轻链只有一个型。在一些低等的脊椎动物中，轻链还存在另一种类型，称为ι型。每条轻链也包含恒定区和可变区两个结构域。轻链长度大约在-个氨基酸。
Fab和Fc片段
以IgG为例，通过木瓜蛋白酶水解的抗体会产生两个片段，Fab（fragmentofantigenbinding）和Fc（crystallinefragment）。其中Fab段是含有重链和轻链的可变区，是抗体特定的两个“手臂”，可以特异性识别和结合抗原。而Fc段是可结晶段，相当于Ig的CH2和CH3结构域（IgM/IgE还包括CH4结构域）,是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。在体内，Fc是发挥ADCC等调理作用的片段，在常规检测实验中，是二抗结合的主要部位，也可以直接结合酶和荧光染料来标记抗体的片段。
Ig可以被木瓜蛋白酶水解成2个Fab段和1个Fc段，也可以被胃蛋白酶从铰链区断开，水解成一个F(ab)2段和一个Fc段。F(ab)2是由两个Fab和铰链区组成，能同时结合两个表位，可以产生沉淀和凝集反应。
抗原和抗原分类
使机体产生体液免疫和细胞免疫的物质称为免疫原（immunogen）。免疫原诱发特异性免疫应答的特性称为免疫原性（immunogenicity）。能和免疫应答产物（抗体和免疫细胞抗原受体）相结合的物质称为抗原（antigen）。抗原和抗体等免疫应答产物起反应的特性称为抗原性（antigenicity）。
通常情况下，免疫原和抗原这两个名词使用时区分不严格，我们一般所说的抗原默认是指具有免疫原性和抗原性的物质。
抗体或免疫细胞通常仅识别抗原大分子上的一个特定部位，称为表位（epitope）或抗原决定簇（antigenicdeterminant）。表位代表抗原分子上一个免疫活性区，负责和免疫细胞表面的抗原受体和抗体分子相结合。根据抗原是否具有免疫原性可以将抗原分为完全抗原和半抗原两类。完全抗原具有良好免疫原性和抗原性。完全抗原中免疫原性最强的是蛋白质抗原。半抗原本身不具有免疫原性，仅具有免疫反应性，又称为不完全抗原，类脂质与大多数多糖均为半抗原，需要和载体偶联方可具有免疫原性。
小分子量的多肽就属于一类半抗原，往往需要和载体蛋白结合才可以刺激机体免疫应答，通常多肽含有的表位少，缺少空间构象表位。
制备好抗体第一步——抗原的选择
常见抗原主要由以下途径获得：
1.天然蛋白质或天然组织细胞
由于天然的蛋白质存在修饰，而且结构比较复杂（除了线性表位还有构象表位），因此，天然蛋白质是优质抗原，但高纯度的天然蛋白质往往很难获取。大部分二抗是天然蛋白做抗原得到的。很多经典的流式抗体都是用细胞或组织作为抗原得到的，但天然蛋白制备的抗体可能对线性表位识别较差，从而难以用于WB，IHC等应用。
2.重组蛋白
重组蛋白（或融合蛋白）抗原上往往带有多个不同的抗原决定簇。使用重组蛋白做抗原制备抗体是一种外源性抗原提呈诱导免疫应答的天然过程，通过在宿主体内筛选最佳抗原决定簇，启动免疫应答，产生相应的高亲和力抗体。利用该抗原免疫动物获得多克隆抗体是针对多个抗原决定簇的抗体的混合物，在一般应用中能够用于检测天然结构或变性的目标蛋白。相比多肽抗原，除了可用于WB、IHC、ICC、IF，更适用于IP、CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以及ELISA等检测天然蛋白质的实验方法。
3.合成多肽
人工合成多肽只是一个线性序列，针对这个多肽的抗体能否识别天然蛋白质是不确定的，所以在制备抗体之前，多肽的设计很重要。
在难以获得蛋白抗原或者有同源蛋白但只有少量序列存在差异，或是特定位点制备修饰性抗体时可以选择多肽抗原。
所以，用蛋白质作为抗原应是首选。针对家族成员同源性高的蛋白质，则可采用特异性多肽制备区分家族成员的特异性抗体。
Proteintech抗体绝大多数采用全长的人源融合蛋白分子作为抗原，融合蛋白都是属于完全抗原，具有很强的免疫原性和抗原性，产生的抗体具有更高亲和力。
抗体来源
单克隆抗体：传统制备单抗是经过特定抗原刺激产生的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过细胞融合的方法得到杂交瘤细胞，然后再经过选择性培养和克隆化得到稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，将细胞注入实验动物（一般为BALB/c小鼠）腹腔中诱导产生腹水，最后收集腹水纯化得到单克隆抗体。
多克隆抗体：将抗原（纯度越高越好）直接注入到实验动物体内进行免疫，经过3-4次免疫，ELISA测其效价合格后，收集血液待其凝血后离心得到抗血清，纯化后即能得到多克隆抗体。
抗体纯化
为了提高特异性结合目标抗原的免疫球蛋白浓度，抗血清、腹水或细胞上清需要进一步纯化以去除非目标抗原免疫球蛋白和其它血清蛋白。无论是多克隆抗体还是单克隆抗体，纯化方法的选择至关重要，其中单克隆抗体需要根据抗体亚型来选择合适的亲和介质或沉淀方法。多克隆抗体一般选择用抗原蛋白偶联亲和柱进行特异性抗体收集。
怎样纯化抗体才能提高特异性？
目前常用的亲和纯化方式主要是抗原亲和纯化和ProteinA或G纯化。抗原亲和纯化是基于抗原-抗体可逆结合的特性产生的一种纯化免疫球蛋白的方法，通过交联到树脂上的抗原，纯化出与抗原有特异性反应的抗体，这一纯化方法大量的去除了非特异性的免疫球蛋白成分，得到的抗体特异性更高。而ProteinA或G纯化是利用金黄色葡萄球菌的蛋白A(ProteinA)或链球菌的蛋白G(ProteinG)对免疫球蛋白Fc段的高亲和性，从抗血清中去除血清蛋白，这一方法无法去除非特异性免疫球蛋白。用ProteinA或G纯化的多抗通常会有交叉反应，在实验中可能产生背景、杂信号甚至假阳性。
Proteintech生产的多抗都是采用抗原亲和纯化，虽然得率较ProteinA或G纯化的低，但抗体特异性得到很大提高。单克隆抗体大部分采用ProteinA或G的纯化方法，因为小鼠腹水成分比抗血清简单且杂抗体含量比例小，采用这一方法得到的单抗浓度高且特异性不受干扰。
第二章抗体的选择和验证
目前市面上大多数抗体公司的抗体总数量是靶抗原数量的数倍甚至数十倍，对于某一特定的靶抗原，存在不止一种商品化抗体，因此抗体的选择对实验需求来说十分重要。为了快速地选择合适的抗体，购买抗体时通常要注意以下几个选择原则。
样品的种属
系统发育树中亲缘关系较近的种属之间同一蛋白质往往具有很多同源氨基酸序列，抗体也往往可以和多个物种的同源靶蛋白反应，选择抗体时可以首先考虑已验证过样品物种的抗体。
抗体宿主的种属
在配合使用标记二抗和未标记一抗检测样品时，一定要十分注意一抗的宿主种属。一般而言，产生一抗的宿主应尽可能的和样品的宿主种类不同，以避免配套的二抗与样品中内源的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。有时对于不含有内源性免疫球蛋白样品的检测，如WB的细胞裂解液样品，一抗宿主选择可以不用这么严格。当一抗种属与检测样本相同时，如果常规二抗检测存在明显交叉反应，可以用只针对重链或轻链的二抗，
也可以用HRP-ProteinA/G/L作为二抗。此外，对于间接免疫荧光双染实验，要求两种非标记一抗来源于不同物种的动物，而每一种二抗则特异性识别其中一种一抗。
抗体的标记
抗体的常用标记有酶标和荧光标记等。HRP的酶标抗体可催化底物形成有色沉淀或发出荧光，用于ELISA、免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化等实验。荧光标记的抗体与抗原特异性结合后，借助于荧光显微镜观察会呈现明亮的特异荧光，用于免疫荧光、流式细胞术等实验。
抗体的应用
抗体常常用来检测和分离蛋白，在各种免疫学实验（ELISA，Westernblot，IF，IHC等）中扮演着不可或缺的角色，其中融合蛋白抗原产生的抗体比多肽抗原产生的抗体应用范围更为广泛，适用于多种应用检测。
抗体特异性验证方法
目前科学界公认的常用抗体特异性验证方法包括：天然阴性样本、酶法检测技术、RNA干扰技术、KnockOut技术。抗体特异性从始至终备受Proteintech的重视，为了给全球科学家提供更多更好的优质特异性抗体，Proteintech于年率
先采用siRNA（RNA干扰技术）验证抗体的特异性，年又陆续启动了KnockOut（敲除）技术和免疫捕获结合质谱分析技术（IP-MS）等来验证抗体特异性。
RNA干扰技术
RNA干扰（RNAInterference）是与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）所诱导的一种特异性基因沉默，可以迅速阻断基因活性。siRNA（SmallInterferingRNA）是一种小RNA分子（大约21-25核苷酸），siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA，其调控的机制是通过互补配对来降低相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。
在抗体特异性检测中，可以通过这种“基因敲降”的方法来验证目标蛋白表达量降低时，抗体与抗原发生结合产生的目的条带是否会消除或降低。
KnockOut技术
基因敲除（KnockOut，KO）是一种遗传工程技术，敲除目的基因，产生目的蛋白不表达的阴性样品，从而使部分功能丧失，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。在抗体特异性检测中，可以通过这种“基因敲除”方法来验证目标蛋白缺乏时，抗体是否会发生非特异性结合。
天然阴性样本
部分蛋白质存在组织、细胞特异性，可以利用天然不表达的细胞或组织作为阴性对照：如CD20不在T细胞中表达，PAX8不在Hela细胞中表达。此外，某些蛋白质在特定的生理条件下才表达，或降低表达，或表达量的改变，也可以作为特异性的参考依据。
酶法检测技术
蛋白质通常会有一些修饰形式，如磷酸化，糖基化等，可以通过检测修饰前后westernblot条带的变化来判断抗体的特异性，这时候就需要添加相应的酶来去除这些修饰形式，如磷酸酶，糖苷酶等。酶法检测是验证抗体特异性的较为迅速简便的方法。
抗体的浓度和效价
抗体浓度和效价通常是科研工作者
本文编辑：佚名
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