作者信息
郭徽灵胡世平汤发强吴宏郑建章
福建医科大学省立临医院骨一科
基金项目：年省卫生计生青年科研课题资助项目（-1-6）
本文发表在《福建医药杂志》年第2期
骨肉瘤是一种恶性程度极高的骨组织来源的原发性肿瘤，其发病早、进展迅速，死亡率与致残率均居高不下。尽管近年来医疗水平快速增长，但骨肉瘤的5年总体生存率依然令人绝望[1]。肿瘤的发生和发展与血管的形成有着密不可分的联系，国内外学者认为，血管生成素，特别是血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）与肿瘤的发生发展密切相关[2]。为进一步了解Ang-2与骨肉瘤之间的关系，笔者构建骨肉瘤大鼠模型，观察Ang-2在大鼠骨肉瘤建模不同时期的表达及其对骨肉瘤细胞的调控作用，旨在为骨肉瘤的诊断及潜在治疗提供实验室依据。
1材料与方法1.1细胞株和动物：MG63（人骨肉瘤细胞）细胞购于湖南丰晖生物；SPF级雄性BALB/c裸鼠25只，体质量20～22g[上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）-]，喂养于严格消毒的无菌层流动物房内，环境温度24～26℃，空气湿度40%～60%，饲料和水经过严格消毒后进食。
1.2 试剂和仪器：1）主要试剂：DMEM基础培养基，青霉素-链霉素混合液（Hyclone），胎牛血清，胰蛋白酶，Opti-MEM培养基（Gibco），Lipofectamine?，转染试剂（Invitrogen），AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，细胞周期检测试剂盒（南京凯基），RNAisoPlus（TaKaRa），小鼠血管生成素2（Ang-2）检测试剂盒（江莱生物）。2）主要仪器：CO2培养箱及烘箱（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），荧光倒置显微镜（日本NIKON），移液器（德国Eppendorf），离心机（中国白洋），流式细胞仪（美国BD公司），酶标仪（美国BIO-RAD公司）。1.3方法：1.3.1移植瘤动物模型建立及分组：MG63细胞于DMEM高糖完全培养基，置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，经消化、离心、重置后按比例传代或接种。实验组20只，取对数生长期MG63细胞悬液/mL，按0.1mL/只接种于裸鼠股骨下段髓腔内，制备裸鼠移植瘤模型；对照组5只同部位注射0.1mL生理盐水。瘤体接种后观察大鼠生存状态，分别于接种后5、10、15、20d随机取出5只大鼠分组，经眼眶后静脉丛取少量血液，制备血清样本；同时收集对照组血清样本。实验组大鼠采血后处死，切开皮下并剥离股骨，将股骨下段迅速切成小块，置于4%多聚甲醛固定，用于HE染色及免疫组化分析。1.3.2Ang-2的ELISA检测和免疫组化分析：1）血液样本rpm离心20min，取上清液于-80℃保存。实验前将血清及ELISA试剂盒从冷环境取出在室温平衡后，参照说明书要求操作，最终在nm波长处测定A值。2）固定液中取出的组织置于包埋盒中，进行梯度脱水、浸蜡、包埋、切片、烘烤、脱蜡至水备用。取部分制作好的玻片先后置于苏木素及伊红溶液染色、晾干、封片，用显微镜采集图像；另一部分玻片进行抗原修复，用Ang-2抗体（稀释比例1:）4℃过夜、滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG，37℃下孵育30min后行DAB显色。在显微镜下观察并随机取5个视野拍照(×)，以出现棕黄色颗粒作为阳性表达的判断标准。结果采用ImageJ软件对每张图片中的阳性细胞数进行统计分析。1.3.3敲减Ang-2基因表达的shRNA慢病毒穿梭载体构建：设计合成特异性敲低Ang-2基因的特异性shRNA，选择BshT1和EcoRI作为酶切位点，然后将引物离心至Ep管底，退火互搭后进行T4酶连接，转化后挑取2个菌落，摇菌后送测序。将测序比对正确的克隆，后将质粒进行扩增、提取。再取对数生长期的MG63骨肉瘤细胞，用含EDTA的胰酶消化重悬细胞并接种于6孔板上，汇合度至80%～90%时进行转染。1.3.4流式检测细胞周期及细胞凋亡：1）细胞周期检测：细胞转染后设立干扰组，同时设置未敲减Ang-2基因shRNA转染的为对照组及未任何处置的空载组。消化收集细胞，并根据样本数量，计算所需染色工作液体积；临用前将RNaseA:PI工作液按1:9体积配制成染色工作液。收集并调整细胞浓度为1×/mL，取1mL单细胞悬液，离心去上清后加入冷乙醇μL固定，PBS洗去固定液，加入μL染色工作液，室温避光30～60min后上机检测细胞周期。2）细胞凋亡检测：细胞转染后用不含EDTA的胰酸消化收集，PBS洗涤2次，收集（1~5）×细胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC及PropidiumIodide混匀，室温、避光反应5～15min，在1h内用流式细胞仪观察和检测细胞凋亡。1.4统计学方法：采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析。结果以均数±标准差表示，多组数据之间比较采用单因素方差（ANOVA）分析，两组数据之间比较采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大鼠血清Ang-2水平：实验组Ang-2在4个不同阶段较对照组（测定值为0）均明显升高，差异有统计学意义；血清Ang-2在5、10d时的水平逐渐升高，10d时达到顶峰，与其他时段相比的差异均有统计学意义（图1）。
2.2瘤组织HE染色：瘤组织在5d时组织中细胞浆较多，细胞核浸润胞浆；10d时瘤细胞排列密集，细胞胞浆较少，核染色质聚集深染；15d和20d时部分细胞核聚集成团，胞浆增多（图2）。
2.3瘤组织免疫组化染色：在10d时，组织中Ang-2的阳性细胞数最高；在15d和20d时，组织Ang-2的阳性细胞数逐渐降低。见图3。
2.4流式检测细胞周期：与对照组相比，Ang-2基因干扰组S期细胞数减少，G1期细胞数增加（P0.05）。结果提示细胞被阻滞在G1期，干扰Ang-2基因可调控细胞周期。见图4。
2.5流式检测细胞凋亡：与对照组相比，Ang-2基因干扰组细胞凋亡数目显著升高（P0.05）。结果提示干扰Ang-2基因可提高细胞凋亡比例。见图5。
3讨论骨肉瘤多发生于儿童以及青少年的长骨干骺端，以股骨下端及胫骨上端为甚[3-4]。发病年龄的高峰主要集中于25岁之前，是青少年第三大常见的原发性恶性肿瘤，仅次于白血病和淋巴瘤[5]。在临床上，绝大多数骨肉瘤患者是由于出现静息痛或发现肢体局部包块而就诊，但此时骨肉瘤常常已经进展到了中晚期，且其恶性度高，进展迅速，早期即可发生远处转移，尤以肺部转移为甚，极易错过早期的绝佳治疗时机。故早期难以发现和诊断是骨肉瘤诊治所面临的最大难题之一。
近年来，有研究者将血清碱性磷酸酶（ALP）用于骨肉瘤的诊断，且被认为与肿瘤大小呈正相关[6]。但因儿童在生长发育期会出现生理性ALP增高，其活性可超过正常人的1～2倍，而青少年进食脂肪含量高的食物后，也会出现ALP增高。而骨肉瘤又多发于儿童和青少年，这限制了ALP的诊断价值和意义。本研究发现，大鼠血清Ang-2含量在其骨肉瘤成瘤的早期就明显升高，与对照组比较的差异有统计学意义，且Ang-2蛋白在瘤组织中也呈高表达状态。这表明Ang-2对骨肉瘤的诊断有意义，对早期发现有一定的价值。有学者对不同分期的骨肉瘤患者血清进行Ang-2含量测定，发现Ang-2表达升高，且与骨肉瘤临床分期呈正相关，故建议Ang-2也可用于骨肉瘤临床分期及预后的评估，这与本研究相符[2]。但有学者研究发现，在胶质瘤、血管肉瘤、乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌等组织中Ang-2均呈高表达，故Ang-2对骨肉瘤诊断的特异性不容乐观[7-8]。
肿瘤的发生发展都与血管的形成有着密不可分的联系。肿瘤组织的生长离不开新生血管提供营养，多种因素在血管新生方面起调控作用。有研究表明，Ang-2在肿瘤血管形成发展中起到了重要的作用[9-10]。骨肉瘤发病早，进展迅速，早期便可出现血行转移，这也是骨肉瘤致死的重要原因，而血行转移的关键因素便是新生血管的形成。那Ang-2与骨肉瘤细胞生长关系如何呢？有学者报道，其通过上调Ang-2表达，发现能够促进骨肉瘤的血管新生，从而促进骨肉瘤的发生发展[11]。另有学者报道，Ang-2可有效调节血管生成，且在骨肉瘤患者出现淋巴转移或血行转移后，其含量明显升高[12]。这说明血管新生和骨肉瘤生长有密切的相互作用。一方面，骨肉瘤的迅速生长和细胞的代谢加速，导致了血管新生；另一方面，血管新生也加速了骨肉瘤的生长。本研究通过敲减Ang-2基因表达，并转染至MG-63骨肉瘤细胞中，发现细胞分裂会被阻滞在G1期，并会加速细胞凋亡。这为骨肉瘤的潜在治疗方法提供了实验室依据。
综上所述，在骨肉瘤大鼠的血清中，Ang-2的含量早期即可明显升高，且抑制Ang-2的基因表达，可促进骨肉瘤细胞凋亡。提示，Ang-2检测可能作为骨肉瘤的早期诊断及潜在治疗的一个新的参考指标。
为了便于阅读，参考文献（略）
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本文编辑：佚名
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