苏木精-伊红染色方法，简称HE染色方法，是病理学常规制片最基本的染色方法，应用广泛。
染色作用
染料与被染物质结合后着色的过程是相当复杂的,应该说大多数染色的原理至今仍未完全搞清楚。目前大家比较认同的观点是:在染色过程中染料与被染物质间既有物理作用,又有化学作用,是两者共同作用的结果。
1.物理作用包括毛细现象、吸附作用、吸收和溶解作用等
(1)毛细现象:当含有细微缝隙的物体与液体相接触时,液体靠表面张力沿细微缝隙上升或扩散。它是染色过程中的第一步,这是纯粹的物理作用,相当于混合,所以结合不牢固,因此也不能称为染色。
毛细现象
(2)吸附作用:一种物质把它周围的另一种物质的分子、原子、离子集中在界面上的过程叫吸附作用。具有吸附作用的物质叫吸附剂,被吸附的物质叫吸附物。
吸附作用分物理吸附和化学吸附两种：
物理吸附由范德华力引起,作用力较弱,吸附为多分子层,无选择性,吸附热小,吸附速度快;化学吸附是形成化学键的结果,作用力较强,是单分子层吸附,有选择性,吸附热大,吸附速度慢。在低温和常温下进行的吸附一般是物理吸附,在较高温度下的吸附常为化学吸附。
(3)吸收和溶解作用:吸附物如果进入吸附剂的内部并均匀地分布在其中,称为吸收;溶解作用的原理类似物理萃取,从广义上讲溶解属于吸收作用的范畴。如脂肪染色,当苏丹染料的醇溶液与组织细胞中的脂质接触时,染料就从溶液中转移到脂质中去,使脂质着色。
吸附作用
(4)分子间的作用力:分子间的作用力包括取向力、诱导力和色散力,由范德华首先提出,所以这种力又叫范德华力。在三种作用力中,色散力是主要的作用力,其次是诱导力,而取向力最弱,只在较大极性的分子间才起作用。
2.化学作用
组织细胞内化学物质的分子中含有酸性、两性、碱性三类基团,在一定条件下,被染物质分子的这些基团与染料分子的助色团发生化学结合而着色。化学结合的主要方式为离子键、共价键和氢键。在化学作用下的结合一般比较牢固,但对于染料溶液酸碱度的依赖性也比较强。
由于在同组织细胞内往往含有多种不同酸碱性的结构和成分,同一分子在不同条件下所表达的酸碱性也有差异:如蛋白质会根据不同的环境,产生酸碱不同的二性电离。所以为了达到最佳的染色效果,我们在染料的选择过程中,对染料的pH、染色过程都要认真考虑,尽量避免交叉染色和共染现象的发生。
化学键
了解了染色之后，分子与分子之间碰撞出的火花是不是感觉很奇妙呢？还有更奇妙的在后头哟，接下来让我们开始解读神秘的HE染色吧！
苏木精-伊红染色简称HE染色,是细胞与组织学中应用最为广泛的染色方法。苏木精是从苏木树的树心中提炼出来的,为浅褐色结晶或淡黄褐色的粉末状物。苏木精本身并没有染色能力,经过氧化后,便能产生具有染色能力的苏木红,苏木精变成苏木红的过程称为成熟。
成熟的方法般有两种:
一种是自然氧化,把配制好后的苏木精液放在开口瓶中2个月以上,通过空气中氧的作用使之氧化、成熟。自然氧化的苏木精液效果稳定,使用寿命长,但由于成熟速度慢,很少用于常规切片。
另一种是化学氧化,在苏木精液中加入氧化剂,如氧化汞、碘酸钠、过氧化氢、高锰酸钾等,用这种方法配制的苏木精一般第二天即可使用。化学氧化的苏木精液刚配好时氧化不充分,着色能力偏弱,放置段时间后会慢慢成熟,着色能力也会慢慢增强。
但是要注意的是,当苏木精完全成熟以后,继续存放就会引起苏木精的过氧化,随着存放时间的延长,苏木精的选择能力下降,核浆共染现象越来越明显,同时还会不停地产生氧化膜和黑色结晶。
苏木红本身与组织的亲和力较弱,加入含金属离子的媒染剂后(最常用的是铝离子),便对细胞核具有一定的亲和力,是最常用的核染料。常规苏木精染色的对比染色是伊红,也有少数人采用焰红,焰红比伊红色泽鲜艳,呈桃红色。
细胞核、细胞浆染色
细胞核：细胞核内染色质是主要成分，DNA两条链上的磷酸基团带负电、呈酸性易与带正电的苏木素碱性染料结合被染色，苏木素在在碱性溶液中呈蓝色。
细胞浆：细胞浆内主要成份是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与PH值有密切关系，当PH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，同时酸或碱性染料不易染色；当PH调到6-8时，大于蛋白质的等电点时，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，同时胞核也被染色，核和胞浆难以区分（阴离子）的染料染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阴离子）结合而使细胞浆染色。
染色流程：
(1)切片烤片30~60分钟。
(2)二甲苯(Ⅰ)脱蜡5~10分钟。
(3)二甲苯(Ⅱ)脱蜡5~10分钟。
(4)无水乙醇洗二甲苯1~5分钟。
(5)95%乙醇洗涤1~5分钟。
(6)75%乙醇洗涤1~5分钟。
(7)水洗。
(8)放入苏木精染色5~20分钟。
(9)水洗,显微镜下观察细胞核的深浅,推测分化的时间
(10)1%盐酸乙醇分化数秒。
(11)水洗,显微镜下观察细胞核的深浅是否合适,决定是否蓝化或需要重染或再分化。
(12)染色深浅适中的切片自来水蓝化5分钟。
(13)伊红染数秒。
(14)75%~85%乙醇洗涤30秒。
(15)95%乙醇(Ⅰ)洗涤0.5~2分钟。
(16)95%乙醇(Ⅱ)脱水2~5分钟。
(17)无水乙醇(Ⅰ)脱水2~5分钟。
(18)无水乙醇(Ⅱ)脱水2~5分钟。
(19)二甲苯(Ⅰ)透明1分钟。
(20)二甲苯(Ⅱ)透明1分钟。
(21)中性树胶封固。
结果:细胞核呈蓝色,细胞浆呈粉红色(图ABCDE)。
图A—E，HE染色深浅标准:
A:细胞核染色过浅
B:细胞核染色过深
C:细胞浆染色过深
D细胞浆染色过浅
E:细胞核、细胞浆染色适中,对比鲜明
通过上面对HE的了解，有没有感觉到病理世界的多姿多彩呢。没错，病理的世界真的就是这么奇妙无穷，除了HE染色，还有好多好多其他有趣的知识值得我们去探索学习。时代在高速发展，病理技术也在不断更新，未来还有很多奇妙之旅等着我们，就让我们在病理宇宙中尽情的遨游吧！
引用文献：
1.《简明病理技术》浙江科学技术出版社丁伟、王德田主编
2.《组织病理学技术》北京大学医学出版社周庚寅主编.10
3.医学方《科研人“家常菜”，HE总有你不曾了解的味道！》
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