肠道缓释型包膜丁酸钠对断奶仔猪生长、免疫及肠道功能的影响及机理研究
钮海华王勇马文强冯杰
浙江大学动物科技学院饲料科学研究所
仔猪断奶时遭受多重应激(心理应激，环境应激以及营养应激)后，机体的基础代谢变慢，消化功能会发生紊乱，再加上仔猪本身消化机能发育不完全，从而使仔猪的生长潜力受到严重抑制，表现为腹泻、生长受阻、死亡率高等断奶综合症。其中，腹泻是导致生长受阻和死亡率高的重要原因，已经成为制约仔猪培育的重要因素。饲料酸化剂不仅可以降低胃肠道pH值，激活胃蛋白酶原，刺激消化酶的分泌，改善饲料及胃肠道内的生物安全，还具有促进生长和体内生物调控的作用，并具有抗生素类生长促进剂防病保健的类似功能。医学研究表明，丁酸在小肠水平具有一定的强抗菌功能，抑制病原菌(如大肠杆菌)控制小肠微生物区系，使其处于正平衡，丁酸钠对细胞代谢、免疫系统及微生物区系的选择作用具有一定的正面效应。年农业部将丁酸钠列为新型饲料添加剂，但丁酸钠在动物生产中的应用及其机理研究相对不多。丁酸钠，又称正丁酸钠盐，该产品的有效成份是一种短链挥发性脂肪酸一丁酸。丁酸具有饲料酸化剂的生理作用，但由于丁酸具有游离性和挥发性的特点，畜牧和饲料生产中将其制成相对稳定的钠盐。工业上生产的丁酸钠为白色粉末，对光和热稳定，但丁酸钠具有吸潮性，而且会产生独特的气味，影响饲料加工及动物的摄食。
因此，本项目应用独特的生物包被技术，制备肠道缓释型包膜丁酸钠，研究其对断奶仔猪生产性能、肠道功能及免疫特性方面的影响，并从生理生化角度探讨肠道缓释型包膜丁酸钠对血液生化指标的影响及其作用机理。在理论方面，本研究将进一步丰富猪肠道细菌和酶活营养调控理论，为今后丁酸钠在猪上的综合应用提供科学理论依据。在应用方面，本研究的结果将对丁酸钠应用于畜禽营养实践提供参考和借鉴。
一试验材料与方法
1试验材料
1.1断奶仔猪：28日龄断奶“杜长大”三元杂交仔猪
1.2肠道缓释型包膜丁酸钠，丁酸钠含量为30%，由杭州康德权饲料有限公司提供，商品名为CM；
氧化锌，纯度为99.7%，由浙江三鼎科技有限公司提供。
2试验方法
2.1试验分组设计
表1试验分组
注：试验D组前两周日粮为基础日粮+抗生素+氧化锌，两周之后改为基础日粮+抗生素。
试验E组前两周日粮为基础日粮+抗生素+氧化锌，两周之后改为基础日粮+抗生素+丁酸钠。
2.2日粮营养水平及配方
表2日粮组成及营养水平
Table2TheCompositionandnutrientlevelsofthebasaldiet
1每Kg基础日粮含：Cu40mg；Femg；Znmg；Mn60mg；Se0.3mg；
2每Kg基础日粮含：V-AIU；V-DIU；V-E60IU；V-B26.8mg；泛酸20.0mg；烟酸33mg；氯化胆碱mg。
3以上指标除消化能外，均为实测值。
2.3饲养试验
试验组仔猪采用群饲，自由采食和饮水。正试期21天，猪场按正常免疫程序进行免疫。试验前对猪舍常规进行消毒。试验期间每日记录饲料消耗量，统计腹泻和死亡情况。试验开始和结束时，禁食（自由饮水）12h，称重，计算日增重、日采食量、料重比和腹泻率。其中腹泻发生率（%）=总腹泻头数/（仔猪头数×试验天数）×%
2.4消化试验
饲养试验结束前一周，以Cr2O3为外源指示剂进行消化试验。在饲料中均匀拌入0.5%的Cr2O3（分析纯）。预试期四天，正试期三天。从每组各选体重相近8头猪（公母各半），固定收粪时间在每天下午2-3点，采用直肠收粪法每只猪分别收集与保存，连收三天。粪样采集后立即用10%HCl按5:1比例拌匀，于-4℃密封保存，70℃±1℃烘干，粉碎待测。
按常规方法（GB，GB-38）分析样品中Cr2O3和各养分含量。消化率按以下公式计算：
3样本采集和指标测定
在第21天，每个重复选取体重接近该组平均体重的3头猪，空腹12小时后进行屠宰。
①血样：
血清样品，用培养皿盛取屠宰血，于37℃水浴中静置，待析出血清时吸取血清，rpm/min离心10min，上清液分装于eppendorf管中，置-70℃低温冰箱中保存待测。
血浆样品：取血10ml，加1％肝素抗凝后，转/分钟15min离心后，上清液分装于EP管，-30度保存。置于4℃冰箱中待测。
②器官称重：取胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结用滤纸吸去血渍，剔除脂肪后称鲜重，样品保存在-70℃待用。
③内容物：将十二指肠两端结扎，剪断后取出肠道内容物保存。
4指标测定
4.1血清生化指标的测定
血清总蛋白、白蛋白、尿素氮、葡萄糖、甘油三脂在RX-Daytona全自动生化分析仪上测定。试剂盒购自宁波赛克生化试剂厂和上海复星长征医学科学有限公司。血清游离脂肪酸采用比色法测定，试剂盒由北京普利莱基因技术有限公司提供。血浆D-乳酸浓度测定参照Brandt等（）建立的分光光度法。二胺氧化酶活性测定参照黎君友等（）建立的分光光度法。
4.2免疫指标的测定
4.2.1器官指数
将试验动物屠宰后，剖摘胸腺、脾脏，用滤纸吸去血渍，剔除脂肪后称鲜重，计算免疫器官指数。
免疫器官指数=免疫器官重量(g)/宰前活重(kg)
4.2.2血清中免疫球蛋白和补体水平的测定
均采用免疫浊度法，在全自动生化分析仪上测定。
免疫浊度测定的基本原理：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。
4.2.3肠粘膜固有层中IgA浆细胞水平检测
肠粘膜是营养物质吸收的主要场所，而且具有重要的免疫功能。IgA作为肠道黏膜免疫的标志性分子，在抵抗外来抗原入侵，调理肠道稳态方面起着重要的作用。
染色步骤：
1)石蜡切片，二甲苯脱蜡、无水乙醇、95%、80%、70%乙醇至固化；
2)蒸馏水洗；
3)抗原暴露：采用胰酶消化37°C、15min；蒸馏水洗；
4)PBS5min×3次；
5)3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min；
6)PBS洗5min×3次；
7)滴加适当比例稀释的一抗，4°C过夜。（兔抗IgA为兔来源的多克隆抗体，工作浓度为1:50为丹麦DAKO公司的产品；用PBS代替一抗为空白对照）；
8)PBS冲洗，5min×3次；
9)滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体（DAKO，工作浓度为1:），37°C孵育40min；
10)PBS冲洗，5min×3次；
11)DAB显色液显色3min（DAKO公司），显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应；
12)Harris苏木素液复染细胞核1min，95%、%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
免疫组化染色结果判定方法：镜检免疫组化染色切片，阳性反应信号呈棕褐色或棕黄色着染，细胞核呈浅蓝色。
IgA细胞阳性面积率统计方法：采用病理图像分析系统（MoticImagesAdvanced3.0）对空肠中IgA+细胞含量进行检测。方法：分别取绒毛上部，中部，下部各五个视野，用MoticImagesAdvanced3.0进行灰度分析，求阳性物面积与视野比例，取平均值，得出IgA+细胞面积率。
4.3血清中相关激素水平的测定
血清胰岛素、胰高血糖素和皮质醇的测定采用放射免疫法，于美国PACKARD-γ型计数器上测定，试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
4.4十二指肠内容物中酶活的测定
（1）样品处理：称取一定量的内容物，加入4.0ml生理盐水，匀浆，4℃放置24hr，rpm离心15min，上清液用于测定各种消化酶活性。
（2）淀粉酶活性测定：酶活性单位定义为：每g内容物在37°C与底物作用30min，水解10mg淀粉为一个活性单位(U)。
取0.4mg/ml的淀粉底物缓冲溶液，37℃水浴预热5分钟，加入0.01ml酶液，混匀，37℃精确反应7.5min，加入0.5ml0.01mol/L的碘应用液终止反应，然后加入蒸馏水3.0ml。将反应液于nm波长下，蒸馏水调零，测定各管的吸光度。
所的数据按照以下公式计算：
计算公式：
（3）脂肪酶活性测定：酶活性单位定义为：每g内容物每min内分解1nmol甘油三酯为一个活性单位(U)。
首先将分光光度计于nm处以tris缓冲液调零。取4ml甘油三脂和水制成的乳胶底物缓冲溶液于试管中，37℃水浴预热5分钟，加入0.05ml酶液，迅速用冰箱保鲜膜盖住管口，再用拇指按住，立即颠倒混合5次，迅速倒入比色皿中比色，读取吸光度值A1。将此比色液倒入原试管中置37℃准确水浴10分钟，再用同上法比色读取吸光度值A2。
取底物缓冲溶液4ml加入0.9％氯化钠0.05ml，nm比浊，读取吸光度值As，相当于标准管0.mmol/L的浓度的吸光度值。
所的数据按照以下公式计算：
（4）胰蛋白酶的测定：参照Erlanger（）的方法稍经修改。取0.9ml水加到5.0ml的底物溶液中（底物的配制：将43.5mgDL-BAPABenzoyl-DL-arginine-P-Nitronalide溶解在1.0ml二甲基亚砜中，再用pH为8.2的内含0.02mol/LCaCl2的Tris-HClBuffer定容至ml，底物保存在4℃）混合液于37℃水浴中平衡5min，随后加入0.1ml提取酶液，精确反应10min，加入1.0ml30％的醋酸终止反应。在波长nm处读取吸光度。酶活性定义：每克内容物每分钟每增加0.01个吸光度为一个活性单位（U）。
4.5十二指肠、空肠、回肠PH的测定
在十二指肠、空肠、回肠两端结扎，剪断后用PHBJ-型便携式PH计直接测各肠断的PH值。
5数据处理
所有数据均采用SPSS（15.0）软件中GLM法，按单因子完全随机设计对各项数据进行F值方差分析，并用LSD法进行平均数间的差异显著性检验，参照采用的显著水准0.05（或0.01）作为各项结果的差异显著性判断水准。绘图采用Word6.0（MicrosoftInc）。
二试验结果
1断奶仔猪生长性能和腹泻率
添加丁酸钠对断奶仔猪生长性能的影响见表3。
表3丁酸钠对断奶仔猪生长性能的影响
Table3Effectofsodiumbutyrateongrowthperformanceofweaningpigs
由表3可以看出，试验各组仔猪的初生重无明显差异。与对照组相比，21日龄末重、日采食量和日增重，丁酸钠+抗生素组、氧化锌组和氧化锌+丁酸钠组有显著增加，但此三组间差异不显著。其中氧化锌+丁酸钠组的末重、日采食量和日增重最大。氧化锌+丁酸钠组的料重比最低，但各组之间的差异不显著。与对照组相比，试验组的腹泻率明显下降（P0.05），其中丁酸钠+抗生素组腹泻率最低，比对照组降低了48.76%（P0.05），其次为氧化锌+丁酸钠组，较对照组降低了47.90%。
2丁酸钠对仔猪免疫功能的影响
2.1丁酸钠对仔猪免疫器官发育的影响
丁酸钠对仔猪免疫器官指数的影响见表4。
表4丁酸钠对仔猪免疫器官指数的影响
Table4Effectofsodiumbutyrateonimmuneorganindexinweaningpigs
由表4可知，除抗生素组外，其余四个试验组的脾脏指数、胰脏指数和淋巴结指数比对照组都有显著的上升（P0.05）。其中丁酸钠+抗生素组的胰脏指数最大，比对照组提高了47.54%；氧化锌+丁酸钠组的脾脏指数最大，比对照组提高了50.85%；氧化锌组的淋巴结指数最大，比对照组提高了18.75%。
2.2丁酸钠对仔猪血清中免疫球蛋白及补体水平的影响
丁酸钠对仔猪血清中免疫球蛋白及补体含量的影响见表5。
表5丁酸钠对仔猪血清中免疫球蛋白及补体含量的影响
Table5Effectsofsodiumbutyrateonimmunoglobulinand
本文编辑：佚名
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