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用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中TUNEL法是做的最多的，结果大多数成功，但偶尔也有失败，下面把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。
TUNEL法的实验原理
基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和生物标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。（小编碎碎念：掌握原理是做好实验的先决条件，不少人还以为是抗体抗原反应呢）
TUNEL实验中关键步骤
1、充分脱蜡和水化
脱蜡可以先60oC20min，再用使用二甲苯两次5-10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2、把握好细胞通透的时间
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10-30min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3、适当延长TUNEL反应液的时间
一般是37oC1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4、DAB显色条件的选择
一般DAB反应10min左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5、PBS的充分清洗
在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6、内源性POD的封闭
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
细胞通透的时间选择
1、蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与TritonX等细胞通透剂。
2、蛋白酶K一般工作液浓度为20μg/ml,但浓缩液可配制1-10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（mMTrisHClpH8.0+50mMEDTA）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20oC保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。
3、蛋白酶K反应时间一般为10-30min，具体时间长短与切片厚薄有关，4μm左右的片子可以用10min，但30μm左右的可用30min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。
关键试剂操作条件
DAB显色反应大约需要10min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。
蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。
DNase1一般室温，10min即可。
如何减弱非特异性染色
若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短DAB孵育时间、PBS充分清洗，注意镜下把握好着色。
其他注意事项
1、湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。
2、英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶K)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。
3、复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。
4、PBS用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。蛋白酶K消化蛋白后，需要用封闭液。
5、未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter-POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
6、结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果
7、棕色是阳性细胞没错：苏木精显示的蓝色细胞核，为的是显示整个组织的形态，便于判断阳性细胞所在的位置；棕色+蓝色的细胞核为蓝黑色，趋黑色，所以是可以判断的。如果结果片子全是蓝色的，那就是说没有阳性细胞核。实验失败。Tunel染出阳性后，一般用苏木精可能只需要30秒左右即可。阳性细胞核可以被染上，只不过是蓝黑色而已。注意分辨。Tunel后镜检一下看看阳性细胞核在什么位置；然后再轻度复染即可。注意比较分辨哪些是阳性细胞。
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